Maduración y fecundación de ovocitos bovinos in vitro : participación de las especies reactivas del oxígeno

The role of reactive oxygen species (ROS) in the processes related with gametes and embryo in vitro culture and manipulation is still controversial. It has been proposed that an adecquate level of O2 - (superoxide anion) would be necessary during bovine oocyte in vitro maturation (IVM) in order to i...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Morado, Sergio Adrián
Otros Autores:	Dalvit, Gabriel Carlos
Formato:	Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Facultad de Ciencias Veterinarias
Materias:	Ovinos Bovinos Especies reactivas al oxígeno Vaca Ovocitos Maduración Fecundación In vitro Reproducción
Acceso en línea:	http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=avaposgra&cl=CL1&d=HWA_1253 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/avaposgra/index/assoc/HWA_1253.dir/1253.PDF
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	The role of reactive oxygen species (ROS) in the processes related with gametes and embryo in vitro culture and manipulation is still controversial. It has been proposed that an adecquate level of O2 - (superoxide anion) would be necessary during bovine oocyte in vitro maturation (IVM) in order to increase their developmental competence. In coincidence, a gradual increase in ROS levels has been observed in embryos developing\nfrom 2-cells until morula stage, which could depend on the metabolic changes that occur in the bovine embryo. On the other hand, certain studies have demonstrated the expression of genes which codify for antioxidant enzymes throughout the in vitro culture of cumulusoocyte\ncomplexes. These studies propose that the storage of antioxidants in the oocyte\nduring its growth and maturation (in the forms of mRNA or proteins) would be important for the future embryo to achieve developmental competence.\nThe apparent contradiction in some of the existing reports, together with the results obtained in previous studies in our laboratory, suggest the need to develop further research to determine if ROS play an important role in the meiotic progress and\ncytoplasmic maturation of the oocyte. Therefore, the main aim of this work was to\ndetermine the possible fluctuation in ROS production during in vitro maturation and\nactivation of bovine oocytes and its relation with key events of both processes.\nIn this study, ROS production proved to be fluctuating during the whole process of IVM. A significant difference was observed in ROS generation between 2 and 18h, which could correspond to a period of time which demands a high energy production in the\nrespiratory chain for protein synthesis during the preparatory stages of IVM key events. With respect to oocyte activation, we observed distinct metabolic patterns between non-activated, sperm mediated and parthenogenetically activated oocytes. The different behaviour as regards ROS levels and oxidative activity in sperm mediated and parthenogenetic activation could be related to the difference in the Ca+2 waves which has been documented between both types of activation. The unique Ca+2 wave triggered by parthenogenetic activation would not be efficient to stimulate mitochondria consistently,\nbeing therefore responsible for the lower developmental competence reported in this type of activation. Modulating reduced gluthatione (GSH) levels we observed that although GSH role as antioxidant could be compensated by other components of the oocyte´s antioxidant system, its participation in the maintenance of the meiotic spindle morphology would be essential for maturation.\nWhen we analysed the effect of the modulation of nitric oxide (NO) endogenous\nand exogenous levels on ROS production during IVM, the addition of NO donors proved to be deleterious for maturation regardless of the variations in ROS levels. Therefore, we could conclude that an increase in NO levels in the oocyte could impair meiotic\nprogression both due to the formation of peroxynitrite or due to the inhibition of the\nmitogen activated protein kinase and the maturation promoting factor, which are involved in intracellular signal transduction systems that play a role in maturation. The inhibition of the NADPH oxidase by the addition of an enzymatic inhibitor to IVM medium showed that the inhibition of the enzyme would not generate changes in ROS\nlevels, but the consequent decrease in the generation of O2 - would affect embryo\ncleavage rate, probably due to the participation of this ROS in signalling systems involved in the process of activation. The addition of enzymatic systems to modulate hydrogen peroxide (H2O2) and O2 - levels showed that although the addition of H2O2 and O2\n?- generating systems could be deleterious for oocyte quality, the use of scavengers would alter maturation by interfering\nwith intracelular signaling systems. These results would demonstrate that certain ROS levels are necessary for bovine oocyte maturation, probably due to their participation in\nsignalling systems of the process. Using modulators of the mitochondrial respiratory chain activity we determined that\nthe ATP produced in the mitochondria would be especially important at 12 h, a period of time in which there is a high metabolic activity due to an intense protein synthesis\ncoinciding with the metaphase I ? metaphase II transition. In conclusion, we determined significant fluctuations in ROS levels during the in vitro maturation and activation of bovine oocytes. The observed variations are related to\nkey events of both processes and are relevant to increase the knowledge regarding the\ndevelopmental competence of oocytes and early embryos. These results suggest that it\nwould be important to lead future experiments in order to elucidate if the fluctuations\nobserved only respond to variations in metabolic activity or if certain ROS also play a role in intracellular regulatory or signalling systems. Moreover, further studies on the metabolic\ncontrol of parthenogenetic activation could contribute to improve the performance of\nparthenogentic embryos in different biotechnological applications such as nuclear transfer, cloning and trans genesis.
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These studies propose that the storage of antioxidants in the oocyte\nduring its growth and maturation (in the forms of mRNA or proteins) would be important for the future embryo to achieve developmental competence.\nThe apparent contradiction in some of the existing reports, together with the results obtained in previous studies in our laboratory, suggest the need to develop further research to determine if ROS play an important role in the meiotic progress and\ncytoplasmic maturation of the oocyte. Therefore, the main aim of this work was to\ndetermine the possible fluctuation in ROS production during in vitro maturation and\nactivation of bovine oocytes and its relation with key events of both processes.\nIn this study, ROS production proved to be fluctuating during the whole process of IVM. A significant difference was observed in ROS generation between 2 and 18h, which could correspond to a period of time which demands a high energy production in the\nrespiratory chain for protein synthesis during the preparatory stages of IVM key events. With respect to oocyte activation, we observed distinct metabolic patterns between non-activated, sperm mediated and parthenogenetically activated oocytes. The different behaviour as regards ROS levels and oxidative activity in sperm mediated and parthenogenetic activation could be related to the difference in the Ca+2 waves which has been documented between both types of activation. The unique Ca+2 wave triggered by parthenogenetic activation would not be efficient to stimulate mitochondria consistently,\nbeing therefore responsible for the lower developmental competence reported in this type of activation. Modulating reduced gluthatione (GSH) levels we observed that although GSH role as antioxidant could be compensated by other components of the oocyte´s antioxidant system, its participation in the maintenance of the meiotic spindle morphology would be essential for maturation.\nWhen we analysed the effect of the modulation of nitric oxide (NO) endogenous\nand exogenous levels on ROS production during IVM, the addition of NO donors proved to be deleterious for maturation regardless of the variations in ROS levels. Therefore, we could conclude that an increase in NO levels in the oocyte could impair meiotic\nprogression both due to the formation of peroxynitrite or due to the inhibition of the\nmitogen activated protein kinase and the maturation promoting factor, which are involved in intracellular signal transduction systems that play a role in maturation. The inhibition of the NADPH oxidase by the addition of an enzymatic inhibitor to IVM medium showed that the inhibition of the enzyme would not generate changes in ROS\nlevels, but the consequent decrease in the generation of O2 - would affect embryo\ncleavage rate, probably due to the participation of this ROS in signalling systems involved in the process of activation. The addition of enzymatic systems to modulate hydrogen peroxide (H2O2) and O2 - levels showed that although the addition of H2O2 and O2\n?- generating systems could be deleterious for oocyte quality, the use of scavengers would alter maturation by interfering\nwith intracelular signaling systems. These results would demonstrate that certain ROS levels are necessary for bovine oocyte maturation, probably due to their participation in\nsignalling systems of the process. Using modulators of the mitochondrial respiratory chain activity we determined that\nthe ATP produced in the mitochondria would be especially important at 12 h, a period of time in which there is a high metabolic activity due to an intense protein synthesis\ncoinciding with the metaphase I ? metaphase II transition. In conclusion, we determined significant fluctuations in ROS levels during the in vitro maturation and activation of bovine oocytes. The observed variations are related to\nkey events of both processes and are relevant to increase the knowledge regarding the\ndevelopmental competence of oocytes and early embryos. These results suggest that it\nwould be important to lead future experiments in order to elucidate if the fluctuations\nobserved only respond to variations in metabolic activity or if certain ROS also play a role in intracellular regulatory or signalling systems. Moreover, further studies on the metabolic\ncontrol of parthenogenetic activation could contribute to improve the performance of\nparthenogentic embryos in different biotechnological applications such as nuclear transfer, cloning and trans genesis. Fil: Morado, Sergio Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina Facultad de Ciencias Veterinarias Dalvit, Gabriel Carlos Morado, Sergio Adrián El papel de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los procesos relacionados\ncon la manipulación y el cultivo de gametas y embriones in vitro es controversial. Se ha\npropuesto que un adecuado nivel de (anión superóxido) O2 - sería beneficioso durante la\nmaduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos para aumentar su competencia de desarrollo. En concordancia, se observó un aumento gradual en los niveles de ROS\ndesde el estadio de dos células al de mórula tardía, que podría depender de los cambios\nen el metabolismo del embrión bovino durante su desarrollo. Por otro lado, diversos estudios han demostrado la expresión de genes que codifican para enzimas antioxidantes\na lo largo del cultivo in vitro de ovocitos y complejos ovocito-cumulus y sostienen que para que el embrión adquiera la competencia de desarrollo sería importante también que los\nantioxidantes sean almacenados en el ovocito (como ARNm o proteínas) durante el crecimiento y la maduración. Los reportes aparentemente contradictorios encontrados en la bibliografía y los\nresultados previos de nuestro grupo justifican la necesidad de profundizar la investigación para determinar si las ROS desempeñan un rol importante en el progreso meiótico y/o en\nla maduración citoplasmática del ovocito. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo fue determinar la posible fluctuación en la producción de ROS durante la maduración y\nactivación in vitro de ovocitos bovinos en presencia de diferentes moduladores y su\nrelación con los principales eventos de ambos procesos.\nEn este trabajo la producción de ROS demostró ser fluctuante durante las 22 hs de\nla maduración. Se observó una significativa disminución en la generación de ROS entre las 2 y las 18 hs, que podría corresponder a un período que demanda una alta producción\nde energía por parte de la cadena respiratoria para la síntesis de proteínas requeridas durante las fases preparatorias para los eventos principales de la MIV. En cuanto al proceso de activación, observamos que existen patrones metabólicos diferentes entre ovocitos no activados, activados por espermatozoides y activados\npartenogenéticamente. El comportamiento contrastante observado en las fluctuaciones de\nlos niveles ROS y de actividad oxidativa entre la activación mediada por espermatozoides\ny la partenogenética podría estar relacionado con la diferencia que presentan ambos tipos de activación con respecto a los picos de liberación de Ca+2. El pico único de liberación de\nCa+2 desencadenado por la activación partenogenética no sería eficiente para estimular a la mitocondria en forma consistente, siendo así responsable de la menor competencia de\ndesarrollo observada en este tipo de activación.\nMediante la modulación de los niveles de glutatión reducido (GSH) pudimos\nobservar que si bien el rol antioxidante del GSH podría ser suplido por otros componentes del sistema antioxidante del ovocito, su participación en el mantenimiento de la morfología del huso meiótico sería esencial para que se lleve a cabo la maduración.\nAl analizar el efecto de la modulación de los niveles de óxido nítrico (ON) exógeno\ny endógeno sobre la producción de ROS durante la MIV, la adición de un donante de ON demostró ser perjudicial para la maduración independientemente de las variaciones en los\nniveles de ROS. Por lo tanto, podemos concluir que un aumento en la concentración de\nON en el ovocito impediría el progreso meiótico tanto por la formación de ONOO- como por la inhibición de la enzima Map quinasa y del factor promotor de la maduración, que\nintervienen en sistemas de señalización intracelular claves para la maduración.\nMediante la adición de un inhibidor de la NADPH oxidasa al medio de MIV\ndeterminamos que la inhibición de la enzima no generaría cambios en los niveles de ROS del ovocito, pero la disminución del O2\n- generado por esta enzima afectaría la tasa de clivaje embrionario, posiblemente por la participación de este compuesto en mecanismos\nde señalización intracelular necesarios para la ctivación. Al estudiar el efecto de la adición de sistemas enzimáticos moduladores de los niveles de H2O2 y O2\n- observamos que si bien la adición de sistemas generadores de estos compuestos serían perjudiciales para la calidad del ovocito, el uso de scavengers alteraría el proceso de maduración por intervenir con diferentes mecanismos de señalización intracelular. Estos resultados estarían demostrando que determinados niveles de ROS son necesarios para que el ovocito bovino lleve a cabo la maduración\nposiblemente por participar en sistemas de señalización que intervienen en el proceso. Mediante la adición de moduladores de la actividad de la cadena respiratoria determinamos que el aporte de ATP de la respiración celular sería especialmente importante a las 12 hs, momento en el cual hay una elevada demanda de actividad\nmetabólica con una activa síntesis proteica y que coincide con la transición entre las metafases I y II.\nEn conclusión, se determinó una significativa fluctuación de los niveles de ROS a\nlo largo de la maduración y la activación de ovocitos bovinos in vitro. Las variaciones observadas tienen relación con eventos clave de ambos procesos y son relevantes para\naumentar el conocimiento respecto de la competencia de desarrollo de los ovocitos y los embriones tempranos. Estos resultados justifican la importancia de realizar futuras experiencias para dilucidar si las fluctuaciones responden solamente a las variaciones en la actividad metabólica o si determinadas ROS intervienen además en sistemas regulatorios o de señalización celular. A su vez, estudios posteriores sobre el control\nmetabólico de la activación partenogenética podrían contribuir a mejorar la performance de los embriones obtenidos mediante esta activación en diferentes aplicaciones\nbiotecnológicas como transferencia nuclear, clonación y transgénesis. application/pdf Ovinos Bovinos Especies reactivas al oxígeno spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Vaca Ovocitos Maduración Fecundación In vitro Especies reactivas al oxígeno Reproducción Maduración y fecundación de ovocitos bovinos in vitro : participación de las especies reactivas del oxígeno info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=avaposgra&cl=CL1&d=HWA_1253 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/avaposgra/index/assoc/HWA_1253.dir/1253.PDF

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