Estudio de fagos codificantes de toxina Shiga subtipo 2a presentes en aislamientos nativos de Escherichia coli

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo que coloniza el tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarreas y graves enfermedades, entre ellas, el síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH es una afección severa que afecta con mayor frecuencia a niños menor...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Burgán, Julia
Formato: Artículo revista
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias 2019
Materias:
Medicina veterinaria
Escherichia coli
Síndrome urémico hemolítico
SUH
Bovinos
Toxina Shiga
Acceso en línea:https://www.ridaa.unicen.edu.ar/xmlui/handle/123456789/2173
Aporte de:
Repositorio Institucional de Acceso Abierto (RIDAA) de Universidad Nacional del Centro
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description Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo que coloniza el tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarreas y graves enfermedades, entre ellas, el síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH es una afección severa que afecta con mayor frecuencia a niños menores de 5 años. En niños y adolescentes representa una de las principales causas de insuficiencia renal aguda y crónica, y es el responsable de una importante proporción de los trasplantes de riñón. Es una enfermedad para la cual no existe tratamiento específico y, en los casos más graves, puede derivar en la muerte del paciente. Argentina presenta la mayor incidencia de SUH a nivel mundial. El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC, y el consumo de alimentos derivados contaminados, como la principal vía de transmisión a humanos. El contacto directo con animales portadores, y su entorno, y el contacto persona a persona son otras fuentes importantes de contagio. Varios factores de virulencia han sido descriptos para estas bacterias, pero no se conocen cuáles son las características que definen con certeza a una cepa STEC con capacidad de producir enfermedad grave. El mecanismo de patogenicidad común a todas y que juega un papel esencial en el desarrollo de SUH, es la producción de toxina Shiga (Stx). Diversos subtipos de Stx han sido descriptos y asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades. El subtipo Stx2a es el mayormente asociado a SUH. Dentro del genoma bacteriano, los genes stx se encuentran codificados en bacteriófagos temperados, denominados fagos Stx. Estos fagos, que muestran una gran diversidad, desempeñan un rol fundamental en la patogénesis de STEC: influyen en la expresión de stx, y durante la lisis bacteriana, producto de la inducción de los profagos, se produce la liberación de estas toxinas. Estos fagos también desarrollan un importante papel en la propagación y transferencia de genes de virulencia y, como consecuencia, en la formación de cepas patógenas emergentes. Se han identificado más de 400 serotipos de STEC y alrededor de 100 han sido asociados a enfermedad en humanos. En la mayoría de las infecciones el serotipo involucrado es O157:H7. Sin embargo, en la actualidad existen a nivel mundial muchos casos de enfermedad causados por cepas de otros serotipos. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar los fagos codificantes de stx2a presentes en cepas STEC de distintos serotipos aisladas en Argentina. Para ello se propuso resubtipificar las cepas, caracterizar regiones involucradas en la regulación del ciclo lítico de los fagos, cuantificar los niveles de expresión y de inducción de profagos Stx2a y comparar los resultados obtenidos de acuerdo a distintas particularidades de los fagos y de las cepas portadoras. También se evaluó el comportamiento de un mismo fago en diferentes entornos bacterianos. En cuanto a la resubtipificación, todas las cepas previamente caracterizadas como portadoras del subtipo vt2EDL933 fueron positivas para stx2a. Las cepas que además portaban el/los subtipo/s vt2vha y/o vt2vhb se resubtipificaron como positivas para stx2c y las cepas que presentaban el subtipo vt1EDL933, fueron positivas para stx1a. En la mayoría de las cepas se confirmó la proximidad del gen ninG a stx2 y la presencia del alelo q933, solo o en combinación con el alelo q21. De las cepas negativas para ninG, una fue positiva para el alelo qO111 y el resto negativas para los 3 alelos de q estudiados. En general, las cepas que presentaron el alelo q933 portaban el subtipo stx2a y las positivas para los alelos q933 y q21, portaban stx2a y stx2c. Si bien esta asociación entre subtipos de stx y alelos de q ya ha sido observada en otros trabajos, no es una asociación exclusiva. En cuanto al alelo qO111, se encontró en una cepa genotipo stx1a/stx2a. Los niveles de expresión de stx2a detectados entre las cepas fueron heterogéneos, tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros grupos de trabajo. Sólo en una de las cepas O145:H- de origen humano no se detectó expresión en ninguna de las condiciones. En la mayoría de las cepas tratadas con mitomicina C la expresión de stx2a fue mayor respecto a la expresión basal, con la excepción de una cepa O91:H21 y la O113:H21, ambas aisladas de alimentos, que mostraron una expresión similar en ambas condiciones. Mediante el método de la capa doble de agar se detectó producción de partículas infectivas de fagos en la mayoría de las cepas analizadas. Los títulos de fagos con mitomicina C aumentaron en un rango de entre 1 y 3 órdenes de magnitud con respecto a los títulos fagos inducidos de manera espontánea Algunos fagos produjeron placas de lisis turbias, difíciles de ver y poco definidas. En una cepa O26:H11 y en dos O157:H7, se evidenciaron por hibridación placas de lisis no detectadas visualmente. Por qPCR, los niveles de inducción de fagos Stx2a fueron variables y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros investigadores. El aumento en la producción de fagos Stx2a con mitomicina C también se evidenció en la mayoría de las cepas, en un rango de 1 a 2,5 logs. Las excepciones fueron una cepa O91:H21 de bovino, que produjo similares cantidades fagos en ambos estados, y dos cepas que no produjeron partículas detectables de fagos Stx2a: otra cepa O91:H21 y la O145:H- que tampoco presentó expresión de stx2a. En cuanto a la comparación de los resultados teniendo en cuenta diferentes variables, se observaron: a) mayor expresión basal de stx2a en las cepas O157:H7 que en las O26:H11, pero en respuesta a mitomicina C, mayor incremento en las cepas O26:H11 que en las O145:H- y O157:H7; b) mayor incremento de la expresión de stx2a con mitomicina C en las cepas aisladas de bovino que en las aisladas de humanos; c) niveles basales de expresión de stx2a inferiores en las cepas positivas para q933 que en las positivas para q933 y q21, y en las cepas ninG negativas con respecto a las ninG positivas; d) un mayor aumento en la producción de fagos con mitomicina C en las cepas que portaban sólo el subtipo stx2a con respecto a las que portaban tanto stx2a como stx2c. Por otra parte, se observó una correlación positiva moderada entre los niveles de expresión basales e inducidos. Dado que en la bibliografía no se ha observado una única tendencia en la asociación entre los niveles de expresión de stx2a y de producción de fagos con las distintas características de las cepas, los resultados obtenidos son, en algunos casos, similares a los reportados por otros investigadores. Tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, en los lisógenos generados se detectó expresión de stx2a, placas de lisis y producción de Stx. Comparado con los resultados obtenidos en cada ensayo con la cepa wild type correspondiente, los niveles de expresión estuvieron dentro del mismo orden, la producción de fagos de los lisógenos fue mayor y la cantidad de Stx presente en sus sobrenadantes fue igual o ligeramente menor. En resumen, se encontró que la mayoría de las cepas, independientemente del serotipo y el origen, portaron fagos Stx2a inducibles, mostraron expresión basal de stx2a y aumento en la expresión e inducción de profagos por efecto del agregado de mitomicina C. Además, los lisógenos obtenidos se comportaron de manera similar a las cepas wild type. Estos resultados sugieren que los fagos estudiados aportan características asociadas a una alta virulencia a las cepas que los portan, las cuales, en consecuencia y sin importar su serotipo, representan un potencial riesgo para la salud humana. Las características observadas de los fagos Stx2a presentes en las cepas circulantes en nuestra región, aisladas tanto de bovinos como de humanos, podrían contribuir a la alta incidencia de enfermedad observada.

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