Caracterización de proteínas de la vía de síntesis de centros Fe-S en el sensado de los niveles de hierro y señalización retrógrada en células vegetales

El hierro (Fe) es un micronutriente esencial para las plantas y éstas lo adquieren principalmente del suelo. A pesar de su abundancia, el Fe presente en suelos se encuentra mayoritariamente como óxidos de Fe3+ poco solubles, por lo tanto, está poco disponible para la absorción por parte de las plan...

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Autor principal: Balparda, Manuel
Otros Autores: Gomez Casati, Diego Fabián
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: 2021
Materias:
Centros Fe-S
Niveles de hierro
Señalización retrograda
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/21766
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Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
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description El hierro (Fe) es un micronutriente esencial para las plantas y éstas lo adquieren principalmente del suelo. A pesar de su abundancia, el Fe presente en suelos se encuentra mayoritariamente como óxidos de Fe3+ poco solubles, por lo tanto, está poco disponible para la absorción por parte de las plantas. Para superar esta situación, las plantas han desarrollado mecanismos eficientes para adquirir Fe del suelo, por ejemplo, aumentando su absorción en respuesta a factores de transcripción (FT). Las plantas dicotiledóneas y no gramináceas, como Arabidopsis thalina, desarrollaron un mecanismo llamado 'Estrategia I', mediante el cual la adquisición de Fe ocurre a través de una reducción: la enzima ferroquelato reductasa (FRO2) convierte el Fe3+ en Fe2+ y, posteriormente, un transportador de Fe2+ (IRT1) incorpora el Fe a través de la membrana plasmática hacia el interior de la célula. Además, en la mayoría de las plantas que llevan a cabo esta Estrategia I estudiadas hasta ahora, se observó un incremento en la actividad enzimática de una H+ ATPasa de membrana plasmática que excreta protones de forma activa hacia el espacio extracelular. Los H+ a su vez son necesarios tanto para disminuir el pH de la rizosfera para solubilizar el Fe3+ como así también para generar el gradiente electroquímico de protones para impulsar la absorción de Fe. Actualmente se ha avanzado en la identificación y caracterización de varios FT que regulan las respuestas de deficiencia de Fe en las plantas. Estos FT actúan mediante la activación de los genes diana primarios, como las ferroquelato reductasas y los transportadores de membrana. Brevemente, en las plantas dicotiledóneas, la regulación de los genes de la Estrategia I se encuentra bajo el control del FT FIT1. FIT1 actúa en conjunto con una red de FT entre los que se destacan los de tipo bHLH que se requieren principalmente para la regulación de la respuesta de deficiencia de Fe a nivel de la célula. Una vez que el Fe es absorbido a través de las raíces, es transportado por los haces vasculares hacia los órganos donde es requerido. El Fe bio-disponible está presente como cofactor enzimático, formando principalmente centros [Fe-S] y grupos hemo. Dichas enzimas, como por ejemplo aconitasa y succinato deshidrogenasa (SDH) del ciclo de Krebs (enzimas con centros [Fe-S]) o catalasa (enzima con grupo hemo) tienen participación en vías metabólicas claves para el funcionamiento de la planta, como por ejemplo la respiración celular o la fotosíntesis. En el interior de las células de las plantas son las mitocondrias y los cloroplastos las organelas de mayor demanda del metal, si bien es posible encontrar Fe en vacuolas que son las organelas de reserva; y recientemente se demostró que el núcleo también contiene Fe. Dentro de las mitocondrias y cloroplastos, el Fe cumple una función fundamental en todos los procesos metabólicos internos. Son estas organelas las que deben comunicar el estado nutricional de Fe al núcleo para que pueda actuar en consecuencia. La coordinación entre la expresión génica de los orgánulos y la expresión génica nuclear requiere señales tanto anterógradas como retrógradas. Las señales retrógradas comunican los cambios en el estado metabólico de los orgánulos al núcleo y, en consecuencia, cambian las señales anterógradas que son las señales que parten del núcleo hacia los orgánulos. Los cambios en el estado metabólico de los cloroplastos y/o mitocondrias tienen efectos profundos en el resto de la célula vegetal e implican cambios masivos en los perfiles de transcripción de los genes nucleares. En este contexto, recientemente se han identificado nuevas señales retrógradas, en donde participan metabolitos como 3 ́ fosfoadenosina 5 ́-fosfato (PAP), entre otros. El nucleótido PAP inhibe la actividad de las exorribonucleasas XRN citosólicas y nucleares, modificando así los niveles de distintos transcriptos. PAP se acumula en plantas que carecen de la enzima fosfatasa SAL1/FRY1, que degrada PAP produciendo adenosina monofosfato (AMP) y fosfato (PO3 4-). SAL1 es una fosfatasa que hidroliza un grupo fosfato tanto de fosfonucleótidos como de inositol fosfatos in vitro. La enzima SAL1 se encuentra localizada en mitocondrias y cloroplastos, pero no en el citosol, y está involucrada en varios procesos celulares, sin embargo no se conoce bien el funcionamiento y la regulación de la misma. El análisis del transcriptoma de plantas de Arabidopsis thaliana sal1 y xrn4 mostró que los genes de ferritina AtFER1, AtFER3 y AtFER4, se encuentran regulados positivamente, estableciendo así un vínculo entre la vía de señalización retrógrada PAP y la regulación de los genes de homeostasis de Fe. Con el objetivo de investigar la vía de señalización retrógrada y su relación con la homeostasis de Fe se analizaron tres líneas mutantes de Arabidopsis thaliana con pérdida de actividad de diferentes enzimas que participan en dicha vía: fry1-6 (mutante con pérdida de función de la enzima SAL1); xrn2xrn3 (mutante con pérdida parcial de función de las enzimas XRN2 y XRN3) y xrn4 (mutante con pérdida de función en la enzima XRN4). Se analizaron en principio, los marcadores de alto contenido de Fe dentro de estas líneas en condiciones de suficiencia Fe. Este análisis consistió en la determinación del contenido de Fe y la medición de los genes involucrados en el almacenamiento del metal como AtFER1 y AtFER4. Las tres líneas mutantes presentaron niveles elevados de estos parámetros cuando se la comparó con su par de tipo salvaje. Subsecuentemente, se estudiaron los marcadores de bajo contenido de Fe a través del análisis de los genes involucrados en la captación del metal como AtFIT1, AtFRO2 y AtIRT1 que mostraron una elevada expresión para las líneas mutantes comparadas con la de tipo salvaje. Posteriormente, se estudió el comportamiento de estas líneas en condiciones de deficiencia de Fe, tanto en un medio definido y como en un medio con un pH alcalino (donde se reduce el contenido de Fe3+ y Fe2+ soluble). El primer medio se utilizó con el fin de caracterizar fenotípicamente a estas líneas mutantes y evaluar ciertos parámetros de crecimiento (área de roseta, raíz principal, biomasa, etc). Las tres líneas mutantes presentaron mejores condiciones de crecimiento que su par de tipo salvaje, visualmente afectada por la deficiencia de Fe. El medio de crecimiento con pH alcalino se utilizó para evaluar el sistema de excreción de compuestos fenólicos al medio ambiente, como una vía alternativa al sistema de captación Estrategia I. Tal como se observó para el medio definido, las líneas mutantes presentaron un crecimiento más vigoroso comparado con la de tipo salvaje. A su vez, las líneas mutantes presentaron una sobreexpresión de genes de la vía de síntesis de compuestos fenólicos así como un aumento en la concentración de compuestos fenólicos totales en extracto de raíces y en el medio de crecimiento. En conjunto, estos resultados han demostrado una alteración por parte de las mutantes PAP/SAL1 en la homeostasis de Fe y una mejor adaptación de las mismas a las condiciones de deficiencia de Fe. En segundo lugar, con el fin de avanzar con la caracterización del rol de la enzima HSCB, enzima que participa en el ensamblado de los centros [Fe-S] en la mitocondria, se evaluaron líneas mutantes y sobreexpresantes de Arabidopsis thaliana en esta enzima. Los centros [Fe-S] son pequeñas moléculas inorgánicas con capacidad redox que se cuentan entre los cofactores más antiguos de la naturaleza. La biosíntesis de estas moléculas inorgánicas requiere de un proceso controlado debido a que los iones Fe+2 y azufre (S-2) en sus formas libres son tóxicos para la célula. En organismos eucariotas y procariotas existen varios complejos proteicos encargados de la biosíntesis de los centros [Fe-S] denominados sistemas SUF, ISC y CIA. El mecanismo básico para el ensamblado de los centros [Fe-S] en todos estos sistemas se puede dividir en dos etapas: la unión del Fe y el S a una proteína molde (scaffold) y la transferencia del centro [Fe-S] a las apoproteínas blanco mediado por chaperonas con especificidad variable. Se propone que los centros [Fe-S] son liberados de ISU1, la proteína molde del sistema ISC, mediante la interacción de ésta con HSCA, una chaperona de tipo Hsp70, en colaboración con la cochaperona HSCB, que estimula la función ATPasa de HSCA. Dicha interacción provocaría un cambio conformacional de la proteína ISU1 y en consecuencia el centro [Fe-S] se liberaría de la proteína molde. Se pudo confirmar que la sobreexpresión de AtHSCB produce activación del sistema de incorporación de Fe, acumulación del metal en la raíz y reducción en las partes aéreas, mientras que las plantas knockdown en AtHSCB (hscb) presentaron acumulación de Fe en las partes aéreas, a pesar de tener niveles normales de captación de Fe. A su vez, se midió la actividad enzimática de proteínas que contienen centros [Fe-S], como aconitasa y SDH, tanto en hojas como en raíces. Se observó que las líneas hscb presentaron niveles reducidos en las actividades de aconitasa y SDH tanto en hojas como en raíces cuando se las comparó con la línea salvaje. Para el caso de las líneas sobreexpresantes (HSCB) las actividades enzimáticas aconitasa y SDH aumentaron comparadas con la línea salvaje en raíces, pero este resultado no se repitió para el caso de las hojas, en donde estas actividades resultaron reducidas. Por último, se generaron mutantes de A. thaliana de HSCB sin la región conservada rubredoxina (AtHSCB-Rub), ya que se cree que esta enzima no solo participa en el ensamblado de los centros [Fe-S], sino que tiene un rol regulatorio en el metabolismo de Fe. Se pudo determinar que las plantas mutantes sin el dominio rubredoxina presentaron anomalías en la distribución de Fe tal como ocurre para el caso de las mutantes hscb y HSCB. También, se evaluó la actividad biológica in vitro de esta enzima, así como la posibilidad de formar complejos con AtHSCA e AtISU1. De estos resultados se determinó que dicha región altamente conservada es importante para la actividad del complejo con AtHSCA e AtISU1, pero no es determinante para la formación del mismo. En conjunto, la actividad de AtHSCB es importante para la formación de los centros [Fe-S] en las mitocondrias de A. thaliana; y a su vez tiene un rol regulatorio en el metabolismo de Fe que podría ser a través del dominio conservado rubredoxina.

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