Desarrollo y mecanismos de acción de cepas bacterianas del género Bacillus como biocontroladoras (bioantifúngicos) de hongos fitopatógenos

A. Capítulo 1: Aislamiento de cepas de Bacillus con actividad antifúngica. Las enfermedades y pestes constituyen un problema desde los comienzos de la agricultura. De las estrategias utilizadas para el control de plagas, los pesticidas sintéticos (―agroquímicos‖) son los compuestos más utilizados....

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Bartolini, Marco
Otros Autores: Grau, Roberto Ricardo
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: 2021
Materias:
BACILLUS
BIOFILM
ESPORA
BIOCONTROL
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/21471
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Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
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description A. Capítulo 1: Aislamiento de cepas de Bacillus con actividad antifúngica. Las enfermedades y pestes constituyen un problema desde los comienzos de la agricultura. De las estrategias utilizadas para el control de plagas, los pesticidas sintéticos (―agroquímicos‖) son los compuestos más utilizados. El uso indiscriminado de estas sustancias químicas como controladores biológicos y los reportes cada vez más frecuentes de su potencial toxicidad para los usuarios y el medioambiente, condujeron al desarrollo de compuestos alternativos, ecológicos y naturales. En relación con esto, el uso de sustancias naturales y bacterias amigables con el ambiente con actividad insecticida y fungicidas (agentes biocontroladores) representan una alternativa interesante. En este trabajo de Tesis Doctoral, focalizamos nuestra atención en la caracterización de bacterias formadoras de esporas del género Bacillus aisladas de la región núcleo agronómico argentina. La capacidad de formar esporas hace de los Bacilli un tipo de bacteria biocontroladora atractiva para fines industriales debido a la alta estabilidad y longevidad de las esporas que, después de germinar, pueden generar los productos biocontroladores. En el transcurso de este trabajo de Tesis se aislaron 743 cepas de Bacillus provenientes de muestras de suelo, que fueron ensayadas contra diferentes hongos fitopatógenos de interés agronómico (cepas de Fusarium, Cercospora, Alternaria, Phomopsis, Mucor, Phomopsis, Penicillium, Rhizoctonia y Aspergillus). De estos 743 aislamientos, 75 de ellos presentaron una buena actividad antifúngica y 20 de ellos una excelente actividad biocontroladora de hongos. Debido a la importancia para la colonización de la rizósfera, se seleccionaron 9 de estas cepas por su habilidad de formar excelentes biofilms, su capacidad de colonizar la superficie y su compatibilidad con otras bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Finalmente, se seleccionaron 4 aislamientos (denominados Mag2, Pur4, Teo22 y Ale22) en función de sus propiedades promotoras de crecimiento vegetal directas, colonización de la rizósfera y filósfera de la planta, y diversos efectos positivos indirectos sobre las semillas al germinar y durante los primeros estadios de crecimiento de la planta debido, principalmente, a la producción de compuestos volátiles con actividad biocontroladora. Mediante análisis filogenético por secuenciación del gen que codifica para el ARNr 16S, se determinó que las cepas seleccionadas pertenecían al grupo Bacillus subtilis / Bacillus amyloliquefaciens. Capítulo 2: Rol del factor transcripcional sigma B sobre la actividad antifúngica de Bacillus subtilis. Para responder a las diversas fluctuaciones e injurias del medio en el que se encuentra presente, B. subtilis induce la expresión del factor alternativo de la ARN polimerasa Sigma B, el cual dirige la expresión de un conjunto de genes, aproximadamente 200, que le permiten a la célula poner en marcha una serie de procesos destinados a sobrevivir bajo condiciones adversas. La pérdida de este factor (Sigma B) conduce a un incremento en la sensibilidad frente a diversos tipos de estrés metabólicos y ambientales. De este modo, la inducción de sigB y la de los genes que se encuentran bajo su control, el regulón Sigma B, le confieren a la bacteria una protección general, defensiva y/o preventiva frente a múltiples tipos de estrés (por ejemplo, la presencia de otros microorganismos, hongos, antagónicos). Muchas especies de Bacillus con actividad PGPR (Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal) son capaces de producir potentes biofungicidas y estimular el sistema inmune de la planta cuando se enfrentan a un hongo fitopatógeno. Sin embargo, muy poco se sabe sobre la capacidad de las bacterias PGPR de reconocer al fitopatógeno y el proceso de respuesta. En este capítulo de la Tesis, mostramos cómo en el modelo B. subtilis, la interacción antagonista entre la bacteria y el fitopatógeno Fusarium verticillioides, representa una situación de estrés para la bacteria que conduce a la inducción del factor transcripcional SigB y su regulón sensible al estrés. El crecimiento dual entre F. verticilloides y diferentes cepas isogénicas de B. subtilis afectadas en la vía de activación de SigB, muestran que SigB fue activado y requerido para el biocontrol del hongo. Con respecto a la ruta de señalamiento, la ruta de activación de Sigma B dependiente de la energía, RsbP, fue la que estuvo a cargo de la detección del hongo. Por su parte, las otras dos rutas conocidas de activación de Sigma B, las rutas de detección de la temperatura y la dependiente del estrés medioambiental (RsbU), no participaron en la detección del hongo ni en la respuesta de la bacteria al mismo. La activación dependiente de hongo de SigB incrementa la expresión del operón responsable de la producción del lipopéptido cíclico surfactina (operón srf). Las células de B. subtilis deficientes de SigB producen significativamente menos cantidad de surfactina y los cultivos de B. subtilis mutantes en la producción de surfactina (∆srfAA) fueron completamente incapaces de controlar el crecimiento de F. verticillioides. Estos resultados proveen la primera evidencia de la participación del regulón de respuesta a estrés de un Bacillus PGPR y sus efectos contra los fitopatógenos nocivos en beneficio del desarrollo de la planta. Capítulo 3: Rol del factor transcripcional sigma B sobre la formación del biofilm de Bacillus subtilis. El desarrollo del biofilm representa un modo de vida ampliamente utilizado por muchos microorganismos y se considera la forma más frecuente de crecimiento de los mismos en la naturaleza. Las cepas de Bacillus subtilis son capaces de formar biofilm en la rizósfera de las plantas y desde allí producir efectos beneficiosos para la planta, incluyendo su protección contra enfermedades (por ejemplo, protección contra hongos fitopatogénicos). La formación del biofilm constituye para esta bacteria una estrategia alternativa de crecimiento y desarrollo la cual resultaría conveniente bajo ciertas condiciones. Mediante la utilización de fusiones reporteras transcripcionales lacZ dependientes de Sigma B y el empleo de fusiones transcripcionales del tipo PsigB-gfp, se pudo determinar que el gen sigB es expresado durante la formación del biofilm. La expresión del mismo fue transciente y tuvo lugar en etapas avanzadas del desarrollo del biofilm. La ruta energética dependiente de RsbP controla la activación de SigB durante el desarrollo del biofilm. La ausencia de actividad de Sigma B condujo a una notable disminución en la viabilidad de la población celular del biofilm, lo cual señala un nuevo e importante rol de esta proteína reguladora para el mantenimiento de la homeostasis dentro del biofilm maduro. Cepas mutantes en sigB son capaces de formar biofilms cuyas dimensiones son mayores a las que presentan los biofilms desarrollados por las cepas wt (silvestre), lo cual sugiere que Sigma B está participando en la regulación negativa del crecimiento y desarrollo del biofilm. Mediante mediciones de actividad β-galactosidasa de fusiones reporteras transcripcionales a diferentes promotores de interés, por su participación en el comportamiento multicelular de B. subtilis, descubrimos que en las cepas deficientes en la actividad de Sigma B, la expresión de sinR, que codifica para el regulador maestro (negativo) del desarrollo del biofilm, se encuentra notablemente disminuida. Debido al rol opuesto (positivo) que SinR ejerce sobre la motilidad, dependiente de flagelo (swarming y swiming) de B. subtilis se analizó qué ocurre con este fenómeno en cepas SigB y esto nos condujo a descubrir que Sigma B contribuye a regular, negativamente, los fenómenos de movilidad en B. subtilis. En base a estos resultados planteamos un modelo del desarrollo del biofilm en B. subtilis, que podría ser extendido a patógenos Gram-positivos que expresan ortólogos a Sigma B, donde se incorpora a Sigma B como un regulador clave en la elección del momento más adecuado entre dos estilos de vida diferentes: (i) quedarse en el lugar y no migrar formando estructuras comunitarias estables como los biofilms debido, por ejemplo, a las condiciones favorables encontradas ó (ii) escapar del lugar, migrar debido a que las condiciones actuales no son óptimas, tratando de encontrar y colonizar otros hábitats a través de inducción de la movilidad celular. Capítulo 4: Efecto del manganeso sobre la formación del biofilm y la esporulación de Bacillus subtilis. Las bacterias han evolucionado para adaptarse a diversos ambientes y responder a ciertas condiciones de estrés. La capacidad de sensar y responder efectivamente frente a estos factores ambientales involucra una variedad de sensores y reguladores específicos o globales. La modulación de los niveles de reguladores activos le permite a las bacterias responder a diversas señales a través de un único regulador central de la transcripción y activar o reprimir ciertas vías de diferenciación de manera espacio-temporal. Un modelo de estudio de estas respuestas es B. subtilis que, por ejemplo, en respuesta a la inanición, puede diferenciarse en subconjuntos, experimentando canibalismo, formación de biofilm o esporulación. Estos procesos están gobernados por un sistema de dos componentes expandido denominado ―phosphorelay‖, en el cual el regulador maestro Spo0A se activa tras su fosforilación mediada por una o una combinación de cinco histidin-quinasas sensoras (KinA-E) y a través de dos fosfotranferasas intermediarias llamadas, Spo0F y Spo0B. Cuatro de estas histidin-quinasas se dividen en tres grupos en función de los niveles de Spo0A-Pi cuya formación pueden catalizar. Las quinasas responsables de la formación de los mayores niveles de Spo0A-Pi son KinA-KinB induciendo la esporulación, los niveles más bajos de Spo0A-Pi son formados a través de KinB-KinC haciendo que las cepas de Bacillus activen la movilidad multicelular tipo sliding, mientras que la formación de una cantidad intermedia de Spo0A-Pi estimula la formación de biofilm vía KinC-KinD. KinD induce la formación de biofilm sensando moléculas liberadas por las plantas (por ejemplo polisacáridos) durante la colonización de la raíz. Sin embargo, sobre KinC, se conoce que para poder actuar necesita estar situada en microdominios de membranas formados por las proteínas FloA, FloT y los lípidos poli-isoprenoides sintetizados por YisP, y sólo está reportado el efecto inhibidor del potasio sobre la misma. Por tal motivo, en esta parte del trabajo de Tesis nos centramos, en la búsqueda de señales capaces de activar KinC para favorecer la formación del biofilm. Inicialmente, se trabajó con diferentes cepas domesticadas y no domesticadas (pobres y buenas formadoras de biofilms, respectivamente) con buena y poca capacidad de esporular, Pudimos comprobar que de los diferentes componentes (orgánicos e inorgánicos) de los medios de cultivo más comúnmente utilizados para favorecer la esporulación de B. subtilis, sólo el Mn+2 era capaz de estimular la esporulación a concentraciones no tóxicas, en el rango de 10 μM a 150 μM. Demostramos, mediante la utilización de fusiones reporteras del tipo abrB-lacZ, cuyas actividades dan una idea de los niveles de Spo0A-Pi formados, que el Mn+2 actúa como una señal activadora sobre la histidin-quinasa KinC. Este efecto del Mn+2 sobre KinC también estimula la formación del biofilm y se encuentra conservado en diferentes especies del género de Bacillus. Tanto para la esporulación como para la formación de biofilm, se demostró mediante el uso de diferentes construcciones genéticas in vivo que (i) el Mn+2 no ingresa por los transportadores que mantienen la homeostasis de este ión dentro de la célula, mntH y mntA, (ii) su efecto es independiente de la vía de la surfactina y el potasio y (iii) no necesita estar ubicado en los microdominios funcionales organizados de la membrana para activar a KinC. Utilizando construcciones que sobreexpresan los diferentes dominios de KinC, se encontró que el Mn+2 activa a la quinasa a través de la región de aminoácidos DEK que se ubica en la secuencia que une el segmento transmembrana de la quinasa con su región PAS-PAC. Por último, se encontró que el Mn+2 es capaz de activar la formación de biofilm, pero no la esporulación, sin necesidad del Phosphorelay; un hallazgo que podría permitirnos una mejor comprensión sobre los eventos tempranos de la interacción rizosférica beneficiosa de Bacillus con la planta. Los resultados de esta investigación son altamente novedosos ya que permiten una demostración fisiológica sobre cómo la bacteria podría decidir entre dos estados alternativos (biofilm y esporulación) regulados ambos positivamente por el mismo regulador (Spo0A), primero formaría el biofilm en la zona de la rizosfera a expensas de la estimulación (independiente del phosphorelay) de KinC en presencia de Mn+2 presente en el suelo solubilizado por los ácidos liberados por la raíz de la planta (por ejemplo ác. málico), y luego dentro de éste daría lugar a esporas, de manera dependiente de KinA y KinB (y del phosphorelay) en cuerpos fructíferos del mismo. Capítulo 5: Prueba al nivel de campo y escalado a planta piloto del proceso de producción de biofungicida. La comercialización de un producto a base de bacterias no sólo requiere del proceso de aislamiento, conservación y evaluación de estos microorganismos a nivel de laboratorio, sino que también requieren diseñar un proceso en donde se puedan producir grandes cantidades del principio activo conservando la mayor eficiencia de las propiedades observadas en el laboratorio. Otra parte importante para el desarrollo de estos productos, es que no sólo sea efectivo a nivel planta sino que también sea económicamente rentable su producción. En base a esto y como etapa final de la Tesis, los cuatro aislamientos obtenidos, en el capítulo 1, en función de la actividad PGPR y biofungicida, (Mag2, Pur4, Teo22 y Ale22) fueron utilizados para optimizar el escalado a nivel industrial de las cepas en fermentadores y la formulación de un probable producto comercial. Se estableció que las condiciones óptimas de crecimiento para estos bacilos en fermentadores de 10 litros son de 48 horas en modo batch con las siguientes condiciones: temperatura 37 °C, medio de cultivo SM calidad Standard con sales, agitación 200 rpm, volumen de inoculo 1/100 y el oxígeno disuelto se controló en 50 litros por minuto (LPM), volumen de trabajo de 80% de la capacidad de fermentación. Posteriormente al escalado, se desarrolló un formulado no toxico para el desarrollo de las bacterias ni para la actividad biocontroladora. Esta formulación está compuesta por un protector UV físico y uno químico, que le otorgan una supervivencia a las bacterias a campo cercana a 36 días de exposición solar. Además, estas bacterias fueron compatibles con los coadyuvantes comercializados por la empresa que son utilizados para la aplicación de los productos a campo. Como cierre del trabajo experimental, estas cepas formuladas se utilizaron para ensayos a campo obteniéndose mejores rendimientos y plántulas por metro cuadrado que los testigos. Estos estudios, en conjunto, permitirán el patentamiento, con propiedad intelectual de la UNR y CONICET, y registro de un producto por parte de Rizobacter S.A. (actualmente perteneciente al grupo Bioceres) en SENASA.

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