Mecanismo de señalización retrógada mitocrondrial (RRM) en plantas.

La mitocondria tiene una función crítica en diferentes procesos celulares tales como el metabolismo energético, metabolismo del carbono y nitrógeno, termorregulación, homeostasis del calcio y hierro, regulación de la apoptosis y en la síntesis de grupos Fe-S y hemo. A pesar de que la mitocondria tie...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Peralta, Diego Alberto
Otros Autores: Busi, María Victoria
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. 2019
Materias:
Señalización Retrograda Mitocondrial
Arabidopsis
SINAL7
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/15691
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Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
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description La mitocondria tiene una función crítica en diferentes procesos celulares tales como el metabolismo energético, metabolismo del carbono y nitrógeno, termorregulación, homeostasis del calcio y hierro, regulación de la apoptosis y en la síntesis de grupos Fe-S y hemo. A pesar de que la mitocondria tiene su propio material genético, más del 98% de las proteínas que se localizan en ella están codificadas en el genoma nuclear. De esta manera, el proceso de biogénesis mitocondrial es complicado debido a que requiere una fina coordinación de la expresión de ambos genomas, nuclear y mitocondrial. Por esto, la comunicación entre la mitocondria y el núcleo es una parte esencial en la biogénesis de esta organela. Existen dos mecanismos generales de comunicación entre los genomas, nuclear y mitocondrial. Uno de ellos involucra la regulación retrógrada mitocondrial (RRM) que es un mecanismo de respuesta crucial que tienen diferentes organismos entre los cuales se encuentran las plantas, animales y hongos. Con el objeto de ampliar los conocimientos sobre los mecanismos de señalización núcleo-mitocondria, en el laboratorio se desarrollaron tres modelos de estudio que presentan una disfunción mitocondrial en plantas de Arabidopsis. En los tres modelos, la expresión de los transcriptos del gen seven in absentia like 7 (SINAL7) se mostró alterada, convirtiéndolo en un potencial candidato a participar de RRMs en plantas. SINA (predicha como enzima ubiquitina ligasa E3) ha sido asociada a diversos procesos en plantas, donde el rol como ligasa E3 en la misma, resultaría de gran importancia sabiendo que la ubiquitinación es una modificación post-traduccional que tanto para degradación proteica, como señalización cumplen roles claves en importantes procesos celulares. Además uno de los modelos de plantas con disfunción mitocondrial donde SINAL7 se observó alterado, es una línea deficiente en GAPC1 de Arabidopsis, una enzima citosólica de la vía glucolítica que cumple otros roles además de su actividad catalítica. Sumado a esto, GAPDH el homólogo murino de GAPC1 interactúa con Siah1, homólogo murino de SINAL7 de Arabidopsis, activando una cascada de señalizaciones que desencadenan apoptosis. Con estos antecedentes, durante este trabajo de tesis, se abordó la caracterización in vitro e in vivo de SINAL7. Para esto, se clonó, expresó (en E. coli) y purificó mediante cromatografía de afinidad en columna, la proteína recombinante SINAL7. Posteriormente, se demostró que SINAL7 recombinante presenta actividad ubiquitina ligasa E3, siendo capaz de auto-ubiquitinarse. Además se demostró la interacción de SINAL7 con la proteína GAPC1 mediante las técnicas de far western blot y pull down, donde el residuo K213 en GAPC1 está involucrado en dicha interacción. Se demostró que la interacción de SINAL7 con la proteína de la glicólisis GAPC1, modifica los parámetros cinéticos de la misma. Además se demostró que GAPC1 es blanco de ubiquitinación de SINAL7, siendo mono-ubiquitinada en el residuo K76 de la enzima glucolítica, por la E3 ligasa. Además, la ubiquitinación de GAPC1 abole completamente su actividad catalítica. Posteriormente, con el fin de estudiar el rol de SINAL7 in vivo, se aislaron plantas de A. thaliana mutantes homocigota en el gen SINAL7, donde se demostró que la presencia de GAPC1 en el núcleo celular de plantas de Arabidopsis es dependiente de la presencia de SINAL7 en las plantas. Además se obtuvieron plantas transgénicas sobreexpresantes de SINAL7, que junto a las plantas mutantes, fueron utilizadas en los ensayos de caracterización fenotípica donde se estudió la influencia de SINAL7 en las plantas. De los ensayos realizados en las plantas, se observó que las plantas sobreeexpresantes presentan un mayor vigor que las plantas tipo salvaje y las mutantes, siendo además plantas híbridas que presentan afectada la floración y fructificación. Además se propone mediante experimentos de real time qPCR que algunos genes, parálogos de SINAL7, podrían estar complementando su función en las líneas mutantes que no presentan un fenotipo marcado comparado con las sobreexpresantes. Además se observó un aumento en los niveles de especies reactivas del oxígeno en las plantas sobreexpresantes y un interesante retardo en la senescencia de las plantas determinado por los niveles clorofilas, ausencia de amarilleo característico de la senescencia y por los niveles de transcriptos de genes involucrados en este proceso. Por último, SINAL7 estaría involucrado en los procesos de floración y fructificación, donde la sobreexpresión de SINAL7 acelera la floración e influencia de negativamente la fructificación, según los parámetros fenotípicos analizados en las plantas y los niveles de transcriptos de factores de transcripción involucrados en estos procesos. De esta manera, durante este trabajo de tesis se llevó adelante la caracterización de SINAL7 que mostró gran influencia en parámetros vegetativos y reproductivos del desarrollo en Arabidopsis.

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