Expresión de la mutante hPMCA 4b (ct120) de la bomba de Ca2+ de membranas plasmáticas humanas en células CHO

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Se utilizaron células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa, CHO(dhfr-) para la sobreexpresión de una mutante de la isoforma 4b de la Ca2+ATPasa de membrana plasmática humana, denominada hPMCA4b(ct120) que carece de los 120 aminoácidos C-terminales. Como vector de expresión se utilizó el pED qu...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: García Arguinzonis, Maísa Inés (Autor, autor)
Otros Autores: Adamo, Hugo P. (Orientador)
Formato: Tesis Libro
Lenguaje:Español
Publicado: Diciembre de 1997
Acceso en línea:Registro en la Biblioteca Digital
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Aporte de:Registro referencial: Solicitar el recurso aquí
Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir (FCEN) de Universidad de Buenos Aires
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502 |b Licenciado en Ciencias Biológicas  |c Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales  |g Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini" (IQUIFIB)  |d 1997 
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520 3 |a Se utilizaron células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa, CHO(dhfr-) para la sobreexpresión de una mutante de la isoforma 4b de la Ca2+ATPasa de membrana plasmática humana, denominada hPMCA4b(ct120) que carece de los 120 aminoácidos C-terminales. Como vector de expresión se utilizó el pED que contiene el gen de la DHFR de ratón. El cDNA que codifica para la hPMCA4b(ct120) se trató con las enzimas de restricción apropiadas y se insertó en el vector pED. Las células CHO(dhfr-) fiJeron transfectadas con el vector pED-hPMCA4b(ct120) y 48 horas después de la transfección, las células que incorporaron el vector se seleccionaron por su capacidad de crecer en un medio libre de nucleósidos. Al rededor de dos semanas después, fueron visibles colonias resistentes. Se aislaron cuatro clones distintos y se continuó su crecimiento en medio selectivo. Ensayos de westernblot utilizando el anticuerpo monoclonal 5F10 de membranas microsomales aisladas a partir de cada uno de los clones demostraron que los cuatro clones expresaban la hPMCA4b(ct120). Basándose en la intensidad de las bandas, la masa de hPMCA4b(ct120) fue entre 2 y 5 veces mayor que la de la enzima endógena de acuerdo al clon examinado. El estado fimcional de la enzima se investigó midiendo el transporte de Ca2+ en vesículas microsomales. La actividad de transporte de Ca2+ en los microsomas conteniendo la enzima expresada fiie mayor que la de los microsomas controles, indicando que los clones expresaban una hPMCA4b(ct120) fimcional. Uno de los clones identificado como CHO 2 mostró una actividad aproximadamente 8 veces mayor que el control. Este clon fue sometido a una vuelta de amplificación con 0.02nM MTX obteniéndose tres clones distintos que expresaban la hPMCA4b(ct120), de los cuales uno, CHO 2-2, expresaba una cantidad de hPMCA4b(ct120) ligeramente mayor que el clon que le dio origen. Por otro lado se analizó el efecto de la expresión de la hPMCA4b(ct120) en la proliferación celular. Para ello se hicieron curvas de número de células en fiJnción del tiempo transcurrido desde la siembra de un número conocido de células. Se observó que las del clon CHO 2 mostraron un retardo en el crecimiento entre las 12 y 48 horas posteriores a la siembra.  |l spa 
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