Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas
Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector detransformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo elcontrol de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz deprocesar polipr...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2002
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| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3451_Asurmendi |
| Aporte de: |
| Sumario: | Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector detransformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo elcontrol de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz deprocesar poliproteínas quiméricas y producir la acumulación de varias proteínas a partirde una única unidad transcripcional in vivo. Se expresaron diferentes combinaciones deproteínas (indicadoras, como GFP y GUS, cápsides de PVX, PVY y PLRV, así comoproteínas de defensa antifúngica) in vivo e in vitro. El nivel de acumulación de cadaproteína no dependió de la posición del ORF en la poliproteína. A pesar de lo expuestoel nivel de acumulación total de una proteína expresada a través de la poliproteína puedeser influenciada por propiedades intrínsecas de las mismas. Mediante microscopíaelectrónica se demostró que la cápside de PVY expresada a través de la poliproteína nosólo se procesa correctamente sino que el producto del procesamiento es capaz deformar partículas parecidas a virus (cápsides vacías). Cuando se agregó la señal de exportación al RE del gen de la patatina apoliproteínas conteniendo GUS y GFP, éstas fueron dirigidas al RE en protoplastos detabaco de la línea BY-2. Las plantas transgénicas de papa expresando estas poliproteínasmostraron menor actividad GUS que las plantas control expresando la mismapoliproteína pero sin señal de exportación. Este menor nivel de actividad podría seratribuido a que la proteína GUS resulta glicosilada en el RE. Estos resultados sugierenque la poliproteína es dirigida al RE y luego en el lumen procesada para liberar lasproteínas individuales. Se obtuvieron plantas de papa transgénica expresando poliproteínas conteniendocuatro genes antifúngicos, codificantes para una quitinasa, una glucanasa, AP24 y RIP. Se obtuvieron plantas altamente resistentes a el ataque de R. solani, demostrando elcorrecto procesamiento de la poliproteína y el sinergismo de las proteínas antifúngicasexpresadas para producir resistencia. Se encontró una asociación entre el espaciosubcelular de acumulación de las proteínas glucanasa y AP24 (vacuolar versusapoplásmico) con el nivel de resistencia contra Rhizoctonia. |
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