Rol de la vía de mTORC1 en la evocación de la memoria

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La habilidad para recordar eventos pasados es esencial para numerosos comportamientos adaptativos. La evocación de la memoria es un proceso complejo que involucra la reactivación de la información previamente adquirida desde un estado latente a un estado que permite su expresión. Entender cómo la in...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Pereyra, Magdalena
Otros Autores:	Medina, Jorge Horacio
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2020
Materias:	EVOCACION MEMORIA mTORC1 RECEPTORES AMPA SINTESIS PROTEICA HIPOCAMPO MEMORY RETRIEVAL HIPPOCAMPUS AMPA RECEPTORS PROTEIN SYNTHESIS
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6952_Pereyra
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	La habilidad para recordar eventos pasados es esencial para numerosos comportamientos adaptativos. La evocación de la memoria es un proceso complejo que involucra la reactivación de la información previamente adquirida desde un estado latente a un estado que permite su expresión. Entender cómo la información guardada en el cerebro se expresa es una pregunta central de la neurobiología de la memoria. Sin embargo, la información sobre mecanismos moleculares que subyacen la evocación, incluyendo el requerimiento de síntesis proteica, es escasa y fragmentaria. El complejo mTORC1, un regulador clave de la síntesis proteica, ha sido implicado en procesos de plasticidad sináptica y su requerimiento ha sido reportado para la formación de la memoria. Utilizando la tarea de evitación inhibitoria (EI), evaluamos el rol de mTORC1 en la evocación de la memoria de largo término. La infusión de rapamicina, un inhibidor selectivo de mTORC1, en el hipocampo dorsal 15 o 40 minutos, pero no 3 horas antes del testeo realizado a 24 horas bloqueó reversiblemente la expresión de la memoria incluso en animales que previamente habían expresado memoria. La infusión de emetina, un inhibidor general de la síntesis proteica, provocó un bloqueo similar de la expresión de la memoria. La inhibición de mTORC1 no interfirió con la expresión de una memoria de corto término y en cambio, sí afectó una memoria de largo término testeada a los 7 o 14 días, pero no a los 28 días. El bloqueo de la vía de mTORC1 en la corteza retrosplenial, otra estructura involucrada en la memoria de la tarea de EI también bloqueó la retención de la memoria. Además, la infusión de rapamicina afectó la evocación de una memoria asociada a una tarea con distinta valencia, como el reconocimiento espacial de objetos. Luego, teniendo en cuenta estos resultados, decidimos evaluar los potenciales mecanismos a través de los cuales la vía de mTORC1 participa en la evocación de la memoria. Considerando que mTORC1 es necesario durante la consolidación para incrementar los niveles de la subunidad GluA1 de los receptores AMPA en la sinapsis, primero evaluamos si existían mecanismos similares subyacentes a la evocación de la memoria. La infusión intrahipocampal de oligonucleoótidos antisentido para GluA1, pero no de oligonucleótidos sin sentido para GluA1 3 horas del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento de la tarea de EI bloqueó la expresión de la memoria. El mismo resultado fue obtenido luego de la infusión de oligonucleótidos antisentido para GluA2 3 horas antes del testeo, evidenciando el requerimiento tanto de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA para la evocación de la memoria. Este bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la infusión de los oligonucleótidos antisentido para GluA2 pudo ser revertido por la infusión de GluA23ɣ, un péptido que interfiere selectivamente con la endocitosis de los receptores AMPA, 1 hora antes del testeo llevado a cabo a las 48 horas posteriores al entrenamiento. Luego repetimos este experimento de doble infusión para GluA1(infusión de los oligonucleótidos antisentido de GluA1 3 horas previas al testeo seguido por infusión del péptido 1 hora antes del testeo llevado a cabo 48 horas luego del entrenamiento) pero esta vez el bloqueo de la endocitosis no fue suficiente para compensar la inhibición de la síntesis de GluA1. Después decidimos estudiar el rol del tráfico de las subunidades GluA de los receptores AMPA durante la evocación de la memoria y su relación con la vía de mTORC1.Para ello realizamos un experimento de doble infusión intrahipocampal en el cual primero realizamos una infusión del péptido GluA23ɣ 1 hora antes del testeo en la tarea de EI, seguida por una infusión de rapamicina 30 minutos antes del testeo que se llevó a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento. Observamos que en este caso GluA23ɣ previno el bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la inactivación de la vía de mTORC1. En resumen, nuestro trabajo indica que tanto la síntesis de novo de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA es requerida para la evocación de la memoria y sugiere que la vía de mTORC1 podría regular el tráfico de los receptores AMPA durante la evocación. Finalmente, testeamos si la inactivación de la vía de mTORC1 afecta los niveles de las subunidades GluA1 y GluA2 de los receptores AMPA usando Western Blot. Realizamos experimentos en lo que infundimos vehículo o rapamicina a los animales 30 minutos antes del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento en la tarea de EI y se extrajo el hipocampo inmediatamente después de la evocación. Evaluando la fracción de densidad postsinátptica, enriquecida en membrana postsináptica, encontramos un aumento en los niveles de GluA2 y una caída de GluA1. En la fracción correspondiente a los sitios extrasinápticos (SPM) no encontramos cambios para GluA2 mientras que la caída en los niveles de GluA1 se mantuvo. Para el homogenato total no encontramos cambios en los niveles de expresión de ninguna de estas subunidades. Nuestros resultados apoyan la idea de que la síntesis proteica mediada por la activación de la vía de mTORC1 es necesaria para la evocación de la memoria de largo término. Además, nuestros hallazgos apuntan a mTORC1 como un regulador clave de la evocación de la memoria que impacta en la expresión de diferentes subunidades de los receptores AMPA.
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El complejo mTORC1, un regulador clave de la síntesis proteica, ha sido implicado en procesos de plasticidad sináptica y su requerimiento ha sido reportado para la formación de la memoria. Utilizando la tarea de evitación inhibitoria (EI), evaluamos el rol de mTORC1 en la evocación de la memoria de largo término. La infusión de rapamicina, un inhibidor selectivo de mTORC1, en el hipocampo dorsal 15 o 40 minutos, pero no 3 horas antes del testeo realizado a 24 horas bloqueó reversiblemente la expresión de la memoria incluso en animales que previamente habían expresado memoria. La infusión de emetina, un inhibidor general de la síntesis proteica, provocó un bloqueo similar de la expresión de la memoria. La inhibición de mTORC1 no interfirió con la expresión de una memoria de corto término y en cambio, sí afectó una memoria de largo término testeada a los 7 o 14 días, pero no a los 28 días. El bloqueo de la vía de mTORC1 en la corteza retrosplenial, otra estructura involucrada en la memoria de la tarea de EI también bloqueó la retención de la memoria. Además, la infusión de rapamicina afectó la evocación de una memoria asociada a una tarea con distinta valencia, como el reconocimiento espacial de objetos. Luego, teniendo en cuenta estos resultados, decidimos evaluar los potenciales mecanismos a través de los cuales la vía de mTORC1 participa en la evocación de la memoria. Considerando que mTORC1 es necesario durante la consolidación para incrementar los niveles de la subunidad GluA1 de los receptores AMPA en la sinapsis, primero evaluamos si existían mecanismos similares subyacentes a la evocación de la memoria. La infusión intrahipocampal de oligonucleoótidos antisentido para GluA1, pero no de oligonucleótidos sin sentido para GluA1 3 horas del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento de la tarea de EI bloqueó la expresión de la memoria. El mismo resultado fue obtenido luego de la infusión de oligonucleótidos antisentido para GluA2 3 horas antes del testeo, evidenciando el requerimiento tanto de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA para la evocación de la memoria. Este bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la infusión de los oligonucleótidos antisentido para GluA2 pudo ser revertido por la infusión de GluA23ɣ, un péptido que interfiere selectivamente con la endocitosis de los receptores AMPA, 1 hora antes del testeo llevado a cabo a las 48 horas posteriores al entrenamiento. Luego repetimos este experimento de doble infusión para GluA1(infusión de los oligonucleótidos antisentido de GluA1 3 horas previas al testeo seguido por infusión del péptido 1 hora antes del testeo llevado a cabo 48 horas luego del entrenamiento) pero esta vez el bloqueo de la endocitosis no fue suficiente para compensar la inhibición de la síntesis de GluA1. Después decidimos estudiar el rol del tráfico de las subunidades GluA de los receptores AMPA durante la evocación de la memoria y su relación con la vía de mTORC1.Para ello realizamos un experimento de doble infusión intrahipocampal en el cual primero realizamos una infusión del péptido GluA23ɣ 1 hora antes del testeo en la tarea de EI, seguida por una infusión de rapamicina 30 minutos antes del testeo que se llevó a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento. Observamos que en este caso GluA23ɣ previno el bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la inactivación de la vía de mTORC1. En resumen, nuestro trabajo indica que tanto la síntesis de novo de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA es requerida para la evocación de la memoria y sugiere que la vía de mTORC1 podría regular el tráfico de los receptores AMPA durante la evocación. Finalmente, testeamos si la inactivación de la vía de mTORC1 afecta los niveles de las subunidades GluA1 y GluA2 de los receptores AMPA usando Western Blot. Realizamos experimentos en lo que infundimos vehículo o rapamicina a los animales 30 minutos antes del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento en la tarea de EI y se extrajo el hipocampo inmediatamente después de la evocación. Evaluando la fracción de densidad postsinátptica, enriquecida en membrana postsináptica, encontramos un aumento en los niveles de GluA2 y una caída de GluA1. En la fracción correspondiente a los sitios extrasinápticos (SPM) no encontramos cambios para GluA2 mientras que la caída en los niveles de GluA1 se mantuvo. Para el homogenato total no encontramos cambios en los niveles de expresión de ninguna de estas subunidades. Nuestros resultados apoyan la idea de que la síntesis proteica mediada por la activación de la vía de mTORC1 es necesaria para la evocación de la memoria de largo término. Además, nuestros hallazgos apuntan a mTORC1 como un regulador clave de la evocación de la memoria que impacta en la expresión de diferentes subunidades de los receptores AMPA. The ability to recall past events is essential for several adaptive behaviours. Memory retrieval refers to the access to stored information and its expression in the brain. Understanding how stored information emerges is a main question in the neurobiology of memory that is now increasingly gaining attention. However, molecular mechanisms underlying memory retrieval, including involvement of protein synthesis, are to date poorly described. Mammalian (mechanistic) target of rapamycin complex 1 (mTORC1), a central regulator of protein synthesis, has been implicated in synaptic plasticity and is required for memory formation. Using inhibitory avoidance (IA), we first evaluated the role of mTORC1 in memory retrieval. Infusion of a selective mTORC1 inhibitor, rapamycin, into the dorsal hippocampus 15 or 40 minutes but not 3 hours before testing at 24 hours reversibly disrupted memory expression even in animals that had already expressed IA memory. Emetine, a general protein synthesis inhibitor, provoked a similar impairment. mTORC1 inhibition did not interfere with short-term memory retrieval, while its infusion before test at 7 or 14 but not at 28 days after training impaired memory expression. mTORC1 blockade in retrosplenial cortex, another structure required for IA memory, also impaired memory retention. In addition, pretest intrahippocampal rapamycin infusion impaired object location memory retrieval. Then, taking into account these results, we decided to evaluate the potential mechanisms by which mTORC1 signaling pathway participates in memory retrieval. As mTORC1 is necessary during consolidation to increase AMPA receptors (AMPAR) GluA1 subunits levels at the synapse, we assessed if a similar mechanism accounts for memory retrieval. Intrahippocampal infusion of GluA1 antisense but not GluA1 missense oligonucleotides 3 hours before testing impaired memory retention at 48 hours after training in the IA task. The same result was observed upon delivery of GluA2 antisense oligonucleotides 3 hours before test, thus showing the requeriment of GluA1 and GluA2 AMPAR subunits for memory retrieval. This memory impairment induced by GluA2 antisense oligonucleotides infusion 3 hours before retrieval was reverted by infusion of GluA23ɣ, a peptide that selectively interferes with the endocytosis of GluA2-containing AMPAR, 1 hour before testing at 48 hours in the IA task. We repeated this experiment for GluA1 ASO and surprinsingly this time AMPAR endocytosis blockade was not sufficient to compensate the GluA1 synthesis inhibition. We next studied the role of GluA-subunit trafficking during memory recall and its relationship with mTORC1 pathway. We performed a double infusion experiment in which we first infused GluA23ɣ 1 hour prior testing and then rapamycin 30 minutes before testing at 48 hours after training in the IA task. We found that GluA23ɣ prevented memory impairment caused by mTORC1 inactivation. Our work indicates that GluA1 and GluA2 AMPAR subunits de novo synthesis is required for memory retrieval and suggests that mTORC1 regulates AMPAR trafficking during retrieval. Finally, we tested whether mTORC1 inactivation impacts the recruitment of AMPAR subunits using Western Blots to measure AMPAR subunits levels after testing in the IA task under rapamycin infusion prior test. We found a GluA2 levels increase and a GluA1 decrease at the post synaptic density close in time to memory retrieval while GluA2 levels remain intact at the synaptic plasma membrane fraction (SPM) and the GluA1 decrease persist also at the SPM. No changes in these AMPAR subunits were found in the total homogenate fractions. Altoghether, our findings support the idea that ongoing protein synthesis mediated by activation of mTORC1 pathway is necessary for long term memory retrieval. Also, our results highlight the role of mTORC1 as a key determinant of memory retrieval that impacts on the expression of different AMPAR subunits. Fil: Pereyra, Magdalena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. 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Rol de la vía de mTORC1 en la evocación de la memoria

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