Acción del dermatán sulfato sobre el sistema fibrinolítico

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El dermatán sulfato (DS) es un glicosaminoglicano endógeno, ampliamente conocido por su acción anticoagulante mediante interacción con el cofactor II de la heparina para potenciar la inhibición de trombina. Además, se ha sugerido que aumentaría la actividad fibrinolítica, aunque el mecanismo aún no...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Castañon, María Mercedes
Otros Autores:	Kordich, Lucía Clelia
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2007
Materias:	DERMATAN SULFATO ACTIVACION DE PLASMINOGENO T-PA U-PA RED DE FIBRINA ESTRUCTURA LISABILIDAD DARMATAN SULFATE PLASMINOGEN ACTIVATION FIBRIN NETWORK STRUCTURE LISABILITY
Acceso en línea:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4088_Castanon
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El dermatán sulfato (DS) es un glicosaminoglicano endógeno, ampliamente conocido por su acción anticoagulante mediante interacción con el cofactor II de la heparina para potenciar la inhibición de trombina. Además, se ha sugerido que aumentaría la actividad fibrinolítica, aunque el mecanismo aún no ha sido dilucidado. El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto del dermatán sulfato de alto (DSA) y bajo peso (DSB) molecular sobre el sistema fibrinolítico. Se observó potenciación de la activación de plasminógeno en función del aumento de la concentración de DS. En particular, el efecto del DSA sobre la activación de Gluplasminógeno y Lys-plasminógeno por el activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) y urinario (u-PA) resultó de similar magnitud al efecto de fibrina sobre la activación por t-PA, mientras que el efecto del DSB, a la misma concentración estudiada, fue de menor magnitud. La combinación de productos de degradación de fibrina y fibrinógeno (PDF) y DS no resultó en un efecto adicional sobre la estimulación de plasminógeno por t-PA, sugiriendo que estarían involucrados los mismos sitios de unión. Se observó que el DS no tuvo efecto apreciable sobre la actividad amidolítica de plasmina ni de u-PA y se comprobó por electroforesis (SDS-PAGE) que estaba favorecida la conversión de plasminógeno a plasmina. Los resultados obtenidos por método amidolítico, apoyan la hipótesis de que el DS tiene efecto pro-fibrinolítico mediante una acción potenciadora del proceso de activación de plasminógeno. Se estudió el efecto del dermatán sulfato sobre la formación, estructura y lisabilidad de la red de fibrina. El efecto del DS sobre la cinética de fibrinoformación se caracterizó por aumento de la fase de latencia, disminución de la velocidad de fibrinoformación, prolongación del tiempo de coagulación y disminución de la densidad óptica máxima. Estos geles resultaron más fácilmente compactables, indicando que la red estaría constituida por fibras más frágiles, separadas por compartimientos líquidos más grandes. Por microscopía electrónica se observó que las redes formadas en presencia de DS presentaron una arquitectura más abierta, con igual densidad de fibras, más largas y delgadas que las fibras control. Estas redes resultaron más rápidamente lisadas que las redes control. Por lo tanto, el DS no sólo actúa como regulador de la actividad de trombina, sino además actuaría como modulador de la estructura de la fibrina y su lisabilidad. Se observó disminución del tiempo de lisis del coágulo de sangre entera diluida y del tiempo de lisis de euglobulinas en función del aumento ex vivo de la concentración de DS. Se descartó el efecto anticoagulante del DS en el ensayo de euglobulinas, por lo tanto se concluye que el efecto pro-fibrinolítico observado se debería a un efecto sobre la activación del sistema fibrinolítico, en concordancia con los resultados obtenidos por método amidolítico. En cultivo de células endoteliales 1G11, no se observaron efectos significativos del DSA sobre los niveles intracelulares ni la liberación de t-PA y PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeno). Los resultados de esta tesis demuestran que el DS tiene efecto pro-fibrinolítico y contribuyen al esclarecimiento del mecanismo de acción de este glicosaminoglicano sobre el sistema plasminógeno-plasmina. Además, permiten plantear hipótesis sobre el rol fisiológico del DS.
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En particular, el efecto del DSA sobre la activación de Gluplasminógeno y Lys-plasminógeno por el activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) y urinario (u-PA) resultó de similar magnitud al efecto de fibrina sobre la activación por t-PA, mientras que el efecto del DSB, a la misma concentración estudiada, fue de menor magnitud. La combinación de productos de degradación de fibrina y fibrinógeno (PDF) y DS no resultó en un efecto adicional sobre la estimulación de plasminógeno por t-PA, sugiriendo que estarían involucrados los mismos sitios de unión. Se observó que el DS no tuvo efecto apreciable sobre la actividad amidolítica de plasmina ni de u-PA y se comprobó por electroforesis (SDS-PAGE) que estaba favorecida la conversión de plasminógeno a plasmina. Los resultados obtenidos por método amidolítico, apoyan la hipótesis de que el DS tiene efecto pro-fibrinolítico mediante una acción potenciadora del proceso de activación de plasminógeno. Se estudió el efecto del dermatán sulfato sobre la formación, estructura y lisabilidad de la red de fibrina. El efecto del DS sobre la cinética de fibrinoformación se caracterizó por aumento de la fase de latencia, disminución de la velocidad de fibrinoformación, prolongación del tiempo de coagulación y disminución de la densidad óptica máxima. Estos geles resultaron más fácilmente compactables, indicando que la red estaría constituida por fibras más frágiles, separadas por compartimientos líquidos más grandes. Por microscopía electrónica se observó que las redes formadas en presencia de DS presentaron una arquitectura más abierta, con igual densidad de fibras, más largas y delgadas que las fibras control. Estas redes resultaron más rápidamente lisadas que las redes control. Por lo tanto, el DS no sólo actúa como regulador de la actividad de trombina, sino además actuaría como modulador de la estructura de la fibrina y su lisabilidad. Se observó disminución del tiempo de lisis del coágulo de sangre entera diluida y del tiempo de lisis de euglobulinas en función del aumento ex vivo de la concentración de DS. Se descartó el efecto anticoagulante del DS en el ensayo de euglobulinas, por lo tanto se concluye que el efecto pro-fibrinolítico observado se debería a un efecto sobre la activación del sistema fibrinolítico, en concordancia con los resultados obtenidos por método amidolítico. En cultivo de células endoteliales 1G11, no se observaron efectos significativos del DSA sobre los niveles intracelulares ni la liberación de t-PA y PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeno). Los resultados de esta tesis demuestran que el DS tiene efecto pro-fibrinolítico y contribuyen al esclarecimiento del mecanismo de acción de este glicosaminoglicano sobre el sistema plasminógeno-plasmina. Además, permiten plantear hipótesis sobre el rol fisiológico del DS. Dermatan sulfate (DS) is well-known for its anticoagulant activity through binding to heparin cofactor II to enhance antithrombin action. It has also been suggested that DS has a profibrinolytic effect, although the exact molecular mechanism is as yet unknown. The aim of this thesis was to evaluate dermatan sulfate (high and low molecular weight) action on the fibrinolytic system. An in vitro amidolytic method was used to study the effect of high and low molecular weight-DS on the activation of Glu and Lys-plasminogen by tissue and urinary plasminogen activators (t-PA and u-PA). Both, high and low molecular weight-DS exhibited a stimulating effect on the activation of plasminogen by PAs. Interestingly, high molecular weight-DS stimulated Glu and Lys-plasminogen activation by t-PA and u-PA in a way and to an extent similar to that in which fibrin(ogen) degradation products (PDF) increased the t-PA assay. Meanwhile low molecular weight-DS had a lower effect. No DS had any effect on plasmin or u-PA amidolytic activity. The facilitation of the conversion of Glu-plasminogen to plasmin in the presence of DS was confirmed by SDS-PAGE; high molecular weight-DS effect was greater than low molecular weight-DS in accordance with the chromogenic assays. Moreover, the combination of PDF and high and low molecular weight-DS, respectively, did not further stimulate t-PA activation of either Glu or Lysplasminogen suggesting that both substances may compete for the same binding sites. Through in vitro assays we demonstrated that high and low molecular weight-DS enhance plasminogen activation by u-PA and t-PA, suggesting that the profibrinolytic activity of DS might be via potentiation of plasminogen conversion to plasmin. By fibrinformation kinetic studies, DS prolonged lag phase and coagulation time and decreased velocity and optical density. DS-fibrin networks were more porous made of less resistant to centrifugal force fibers (compactation studies). The networks displayed equal fiber density, which were longer and thinner than controls (electron microscopy) and showed shorter lysis time. Therefore, DS would act not only as a thrombin activity regulator, but as a fibrin structure and lysis modulator. Blood diluted clot lysis time and euglobulin lysis time were shorter in the presence of DS. Since, it was discarded the anticoagulant DS effect in the euglobulin assay, we conclude that DS has a pro-fibrinolytic effect mediated by fibrinolytic activation. These results confirm the previous obtained by amidolytic method. DS action on endothelial 1G11 cells was evaluated by measuring t-PA and PAI levels, and no significant differences were observed. Our results demonstrate that DS has a pro-fibrinolytic effect and contribute to clarify the mechanism of action of this glycosaminoglycan on the plasminogen-plasmin system. Fil: Castañon, María Mercedes. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2007 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4088_Castanon

Acción del dermatán sulfato sobre el sistema fibrinolítico

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