Estudios moleculares de sialidasas de Trypanosomátidos : relación estructura/función

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La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugadoa sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizadaenzimát...

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Autor principal: Buschiazzo, Alejandro
Otros Autores: Frasch, Alberto Carlos C.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1999
Materias:
ENFERMEDAD DE CHAGAS
TRANS-GLICOSILACION
MECANISMO CATALITICO
ESTRUCTURA DE PROTEINAS
CRISTALOGRAFIA POR RAYOS X
SIALIDASAS
TRANS-SIALIDASAS
CHAGAS' DISEASE
TRANS GLYCOSYLATION
CATALYTIC MECHANISM
PROTEIN STRUCTURE
X RAY CRYSTALLOGRAPHY
SIALIDASES
TRANS-SIALIDASES
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3145_Buschiazzo
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugadoa sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizadaenzimáticamente y su gen clonado. Así se demostró en primer lugar, que era una actividad novedosacomo transglicosidasa, ya que no utiliza como sustrato un dador nucleótido-azúcar, que en todas lasotras sialiltransferasas cucarióticas conocidas, es el CMP-siálico. En segundo lugar, el análisis desecuencia reveló una lejana pero evidente homología con varias sialidasas bacterianas, y no con lassialiltransferasas eucariotas. En los últimos años han surgido distintos tipos de evidenciasexperimentales, que involucran a la trans-sialidasa en los mecanismos de adhesión/invasión de T.cruzi a las células del mamífero huésped, en el escape temprano de parásitos invasivos de la vacuolaparasitófora de la célula hospedadora y en la evasión del camino alternativo de fijación delcomplemento. La actividad de trans-sialidasa, ha sido detectada hasta el momento sólo en T. cruzi y en dos parásitostripanosomátidos emparentados, T. brucei y Endotrypanum sp. En algunos otros tripanosomátidosse han encontrado sialidasas, pero sin actividad de transferasa detectable, como en el caso de T.rangeli. Hasta ahora no se sabía si la sialidasa de este parásito no patogénico, estaba relacionadacon la trans-sialidasa. Con el objetivo de comprender el(los) mecanismo(s) en el(los) que la trans-sialidasa está involucrada,en relación a la interacción huésped/parásito, en este trabajo de Tesis se ha avanzado en distintosaspectos del estudio molecular de la trans-sialidasa de T. cruzi y la sialidasa de T. rangeli: 1. Se optimizaron los sistemas de expresión y purificación de la trans-sialidasa recombinante con elfin de obtener grandes cantidades de proteína >95% pura. 2. Se utilizó trans-sialidasa recombinante pura como material inicial para cristalizar y comenzarestudios cristalográficos por difracción de rayos X, tendientes a resolver la estructuratridimensional de la misma. Además de las variaciones convencionales en los métodos ycondiciones de cristalización, y mientras no se obtengan cristales adecuados, se procedió abuscar la separación de dominios parciales de la proteina para cristalizar de formaindependiente. 3. En paralelo con los puntos anteriores, se demostró que la sialidasa de T rangelí es homóloga a latrans-sialidasa dc T. cruzi. Para ello se purificó la sialidasa nativa a partir de sobrenadantesde cultivo de T. rangeli, se microsecuenció y se logró clonar trece genes homólogos, miembrosde lo que hemos denominado la familia multigénica de la sialidasa de T. rangeli. 4. Tres de los genes clonados codifican proteínas recombinantes con actividad de sialidasa comparablea la de la enzima nativa cuando se expresan en Escherichia coli. Uno de ellos fue secuenciadocompletamente, revelando una identidad en aminoácidos de 68.9% cuando se lo comparacon la trans-sialidasa de T. cruzi, aumentando a una similitud dc 86.7% si se admitensustituciones conservativas. 5. Se cristalizó la enzima nativa de T.rangeli sola y ligada a un inhibidor competitivo. Se resolviósu estructura tridimensional a partir del patrón de difracción de rayos X, hasta una resoluciónde 2.2Å. En paralelo se resolvió la estructura tridimensional de la misma proteína acomplejadaal inhibidor hasta 2.9Å. 6. Se modelizó la estructura tridimensional de la trans-sialidasa, tomando como referencia iniciallas coordenadas atómicas de la sialidasa, dada la gran homología entre las dos proteínas. 7. Se construyeron y expresaron moléculas quiméricas entre ambas enzimas con el objetivo deavanzar en la definición de regiones y/o residuos claves en la transglicosilación.
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_version_ 1782022351766945792
spelling tesis:tesis_n3145_Buschiazzo2023-10-02T19:45:20Z Estudios moleculares de sialidasas de Trypanosomátidos : relación estructura/función Buschiazzo, Alejandro Frasch, Alberto Carlos C. ENFERMEDAD DE CHAGAS TRANS-GLICOSILACION MECANISMO CATALITICO ESTRUCTURA DE PROTEINAS CRISTALOGRAFIA POR RAYOS X SIALIDASAS TRANS-SIALIDASAS CHAGAS' DISEASE TRANS GLYCOSYLATION CATALYTIC MECHANISM PROTEIN STRUCTURE X RAY CRYSTALLOGRAPHY SIALIDASES TRANS-SIALIDASES La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugadoa sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizadaenzimáticamente y su gen clonado. Así se demostró en primer lugar, que era una actividad novedosacomo transglicosidasa, ya que no utiliza como sustrato un dador nucleótido-azúcar, que en todas lasotras sialiltransferasas cucarióticas conocidas, es el CMP-siálico. En segundo lugar, el análisis desecuencia reveló una lejana pero evidente homología con varias sialidasas bacterianas, y no con lassialiltransferasas eucariotas. En los últimos años han surgido distintos tipos de evidenciasexperimentales, que involucran a la trans-sialidasa en los mecanismos de adhesión/invasión de T.cruzi a las células del mamífero huésped, en el escape temprano de parásitos invasivos de la vacuolaparasitófora de la célula hospedadora y en la evasión del camino alternativo de fijación delcomplemento. La actividad de trans-sialidasa, ha sido detectada hasta el momento sólo en T. cruzi y en dos parásitostripanosomátidos emparentados, T. brucei y Endotrypanum sp. En algunos otros tripanosomátidosse han encontrado sialidasas, pero sin actividad de transferasa detectable, como en el caso de T.rangeli. Hasta ahora no se sabía si la sialidasa de este parásito no patogénico, estaba relacionadacon la trans-sialidasa. Con el objetivo de comprender el(los) mecanismo(s) en el(los) que la trans-sialidasa está involucrada,en relación a la interacción huésped/parásito, en este trabajo de Tesis se ha avanzado en distintosaspectos del estudio molecular de la trans-sialidasa de T. cruzi y la sialidasa de T. rangeli: 1. Se optimizaron los sistemas de expresión y purificación de la trans-sialidasa recombinante con elfin de obtener grandes cantidades de proteína >95% pura. 2. Se utilizó trans-sialidasa recombinante pura como material inicial para cristalizar y comenzarestudios cristalográficos por difracción de rayos X, tendientes a resolver la estructuratridimensional de la misma. Además de las variaciones convencionales en los métodos ycondiciones de cristalización, y mientras no se obtengan cristales adecuados, se procedió abuscar la separación de dominios parciales de la proteina para cristalizar de formaindependiente. 3. En paralelo con los puntos anteriores, se demostró que la sialidasa de T rangelí es homóloga a latrans-sialidasa dc T. cruzi. Para ello se purificó la sialidasa nativa a partir de sobrenadantesde cultivo de T. rangeli, se microsecuenció y se logró clonar trece genes homólogos, miembrosde lo que hemos denominado la familia multigénica de la sialidasa de T. rangeli. 4. Tres de los genes clonados codifican proteínas recombinantes con actividad de sialidasa comparablea la de la enzima nativa cuando se expresan en Escherichia coli. Uno de ellos fue secuenciadocompletamente, revelando una identidad en aminoácidos de 68.9% cuando se lo comparacon la trans-sialidasa de T. cruzi, aumentando a una similitud dc 86.7% si se admitensustituciones conservativas. 5. Se cristalizó la enzima nativa de T.rangeli sola y ligada a un inhibidor competitivo. Se resolviósu estructura tridimensional a partir del patrón de difracción de rayos X, hasta una resoluciónde 2.2Å. En paralelo se resolvió la estructura tridimensional de la misma proteína acomplejadaal inhibidor hasta 2.9Å. 6. Se modelizó la estructura tridimensional de la trans-sialidasa, tomando como referencia iniciallas coordenadas atómicas de la sialidasa, dada la gran homología entre las dos proteínas. 7. Se construyeron y expresaron moléculas quiméricas entre ambas enzimas con el objetivo deavanzar en la definición de regiones y/o residuos claves en la transglicosilación. The trans-sialidase from Trypanosoma cruzi is an enzyme, which was predicted to exist in 1985, inorder to explain the presence of sialic acid bound to surface molecules of this intracellular parasiteof mammalian cells. Trans-sialidase was later purified, enzymatically characterized and its genecloned. In this way it was shown in the first place, that it is a novel type of transglycosidase, sinceit does not use a sugar-nucleotide as the donor substrate, which is CMP-sialic acid in all the otherknown cukaryotic sialyltransferases. In the second place, the sequence analysis revealed a lowlevel of homology with several bacterial sialidases, and not with eukaryotic sialyltransferases. Overthe last few years different types of experimental evidence have appeared. involving the trans-sialidaseof T. cruzi in the adhesion/invasion mechanisms that the parasite uses in the interactionwith mammalian host cells, in the early escape of invasive parasites from the parasitophorousvacuole in recently invaded host cells and in the parasite evasion from the alternative pathway ofcomplement activation. Trans-sialidase activity has been detected only in T. cruzi and in two related Trypanosomatidaeparasites. T. brucei and Endotrypunum sp. Sialidases have been identified in some other Trypanosomatidae, but lacking detectable transferase activity, as in the case of T. rangeli. Untilnow it was not known if the sialidase from this non-pathogenic parasite, was related with trans-sialidase. In order to understand the mechanism(s) in which trans-sialidase is involved, with respect to hostcell/parasite interaction, this PhD Thesis has contributed to advance in different aspects of themolecular study of the trans-sialidase from T. cruzi and the sialidase from T. rangeli: 1. The systems ofexpression and purification of recombinant trans-sialidase were optimized withthe purpose of obtaining great quantity of highly pure (>95%) protein. 2. Pure recombinant trans-sialidase was used as the starting material in crystallization screenings,looking for suitable crystals to perform crystallographic studies by X ray diffraction, thatwould render its three-dimensional structure. Added to the conventional matrix variationsin the crystallogonesis screenings, and until suitable crystals appear, a simultaneous approachwas performed, searching for the separation of partial domains of the protein that could becrystallized independently. 3. In parallel with these points, it was demonstrated that the sialidase from T rangei is homologousto the the trans-sialidase of T. cruzi. With this purpose, the native sialidase was purifiedfrom culture supernatants of T. rangeli, and microsequenced. Thereafter, thirteen homologousgenes were cloned, and grouped in what we have denominated the multigenic sialidasefamily of T. rangeli. 4. Three of the cloned genes encode recombinant proteins with sialidase activity, similar to thenative enzyme's, when they are expressed in Escherichia coli. One of them was completelysequenced, showing an overall identity of 68.9% at the amino acid level, compared to thetrans-sialidase from T cruzi. The similarity increases to 86.7% if conservative substitutionsare admitted. 5. The T. rangeli native enzyme was crystallized, alone and complexed with a competitive inhibitor. Its three-dimensional structure was solved by X ray diffraction pattern analysis, up to 2.2Åresolution. The three-dimensional structure of the complex with the inhibitor was solvedsimultaneously to 2.9Å. 6. The three-dimensional structure of the trans-sialidase from T. cruzi was modelled, taking theatomic coordinates of the sialidase, as initial reference, given the high homology levelbetween both proteins. 7. Chimeric molecules between both proteins were constructed and expressed. with the purpose ofadvancing in the definition of key regions and/or residues responsible for thetransglycosylation activity. Fil: Buschiazzo, Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1999 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3145_Buschiazzo

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