Canales de calcio y liberación del neurotransmisor en sinapsis normales y en regeneración de la placa neuromuscular de vertebrados
El Ca²+ es un eslabón clave entre la llegada del potencial de acción al terminal sináptico y laliberación del neurotransmisor (Katz, 1969; Katz & Miledi, 1970). El rápido incremento en [Ca²+]ext que ocurre ante la despolarización de la membrana terminal es el resultado de laapertura de canales d...
Guardado en:
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Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
1997
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PLACA NEUROMUSCULAR CANALES DE CALCIO LIBERACION DEL NEUROTRASMISOR TRANSMISION SINAPTICA REINERVACION REGENERACION CORRIENTES PRESINAPTICAS CORRIENTE DE CALCIO CORRIENTE DE POTASIO ACTIVADA POR CALCIO DIHIDROPIRINAS OMEGA CONOTOXINAS OMEGA AGATOXINA IVA NEUROMUSCULAR JUNCTION CALCIUM CHANNELS TRANSMITTER RELEASE SYNAPTIC TRANSMISSION REINNERVATION REGENERATION PRESYNAPTIC CURRENTS PERINEURIAL CURRENTS CALCIUM CURRENT CALCIUM-ACTIVATED POTASSIUM CURRENT DIHYDROPYRIDINES OMEGA CONOTOXINS OMEGA AGATOXIN IVA |
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El Ca²+ es un eslabón clave entre la llegada del potencial de acción al terminal sináptico y laliberación del neurotransmisor (Katz, 1969; Katz & Miledi, 1970). El rápido incremento en [Ca²+]ext que ocurre ante la despolarización de la membrana terminal es el resultado de laapertura de canales de Ca²+ dependientes de voltaje (CCVD) que permiten la entrada de Ca²+desde el medio extracelular (Llinás y col., 1976; Augustine & Charlton, 1986). Basándose ensus características biofísicas y farmacológicas se han descripto varias clases de CCVD, loscuales han sido clasificados en los tipos T, L, N y P (Bean 1989; Llinás y col., 1992; Olivera ycol., l994; Dunlap y col., 1995). Más recientemente han sido descriptos los canales de tipo Q,un tipo de canal estrechamente relacionado con los de tipo P, y los canales tipo R, los cualesson resistentes a cualquiera de las drogas y toxinas antagonistas de los otros tipos de CCVD (Zhang y col., l993; Randall & Tsien, l995). Se ha mostrado que varios de estos CCVD,particularmente los de tipo N, L, P y Q, están involucrados en la liberación delneurotransmisor en diferentes sinapsis (ver Olivera y col., 1994; Dunlap y col., 1995). En Ia placa neuromuscular madura del ratón, la transmisión sináptíca es mediada por laentrada de Ca²+ a través de canales de tipo P (y/o Q) (Uchitel y col, l992; Protti & Uchitel, 1993; Bowersox y col., 1995; Hong & Chang, 1995; Wright & Angus, 1996). En estapreparación se ha demostrado que la w-AgaIVA, un bloqueante de CCVD de tipo P y Q,ejerce un fuerte efecto inhibitorio sobre la liberación de [³H]ACh (Wessler y col., 1995), lascorrientes presinápticas de Ca²+ y sobre la liberación evocada neuralmente y por alto K+ (Protti & Uchitel, l993, Hong & Chang, 1995; Bowersox y col., 1995; Wright & Angus, 1996). En vista de la falta de efectos de la (w-CgTx (Sano y col., 1987, Protti y col., 1991; Bowersox y col., 1995) y las DHPs (Atchinson, 1989), se piensa que los canales de tipo N y Lno tienen una participación significativa en el proceso de liberación en condiciones normales. En la placa neuromuscular de la rana, se demostró que la w-CgTx ejerce un fuerte efectoantagónico sobre la liberación (Kerr & Yoshikami, 1984; Sano y col., 1987; Koyano y col., 1987) mientras que los antagonistas de los canales de tipo L resultan ineficaces (Sano y col., 1987). Se ha demostrado también que los sitios de unión de la w-CgTx están co-localizadoscon las zonas activas de liberación dela presinapsis enfrentados justo a los sitios de unión dela α-bungarotoxina en la postsinapsis (Robitaille y col., 1990; Cohen y col., 1991). Estasevidencias indican que los canales de tipo N se hallan involucrados en el proceso deliberación en este sistema. Durante el curso de la maduración de la unión neuromuscular devertebrados, se han reportado cambios en la farmacología de los CCVD acoplados al procesode liberación en aves (Gray y col., l992) y anfibios (Fu & Huang, 1994). Se desconoce, sinembargo, la farmacología de los canales de Ca²+ acoplados al proceso de liberación en lassinapsis recientemente formadas de la unión neuromuscular de mamíferos. Objetivos El propósito de este estudio fue evaluar por medio de técnicas electrofisiológicas yfarmacológicas que tipos de CCVD están involucrados en la liberación del neurotransmisoren la placa neuromuscular normal de mamíferos (ratón) y anfibios (rana) y correlacionar elperfil farmacológico del proceso de liberación con el de las corrientes presinápticas de calcioy de potasio activada por calcio, Ica, y Ikca, respectivamente. Otro objetivo del presente trabajofue evaluar si se producen cambios en los CCVD acoplados al proceso de liberación durantela reinervación de la placa neuromuscular. Métodos Para estudiar la placa neuromuscular normal del ratón, los experimentos se llevaron a cabo enel músculo diafragma o en el levator auris longus de ratones macho adultos de la cepa Swissde 20-30 g de peso corporal. Para estudiar las placas del ratón durante la regeneración, seutilizaron ratones adultos a los cuales se les había provocado un daño “crush” a la ramaauricular posterior del nervio facial que inerva al levator auris izquierdo. Los animales controly los desnervados en diferentes etapas luego de la restauración de la transmisión sinápticafueron anestesiados e inmediatamente desangrados. Par estudiar la placa neuromuscular de larana los experimentos se realizaron en el músculo cutaneous pectoris de Rana caluesbiana de 40-60 g de peso corporal. Las ranas fueron matadas por doble punción (medular-cerebral). Elmúsculo correspondiente, junto con el nervio motor que lo inerva, fue removido y luegodisecado en una caja de Petri con base de Sylgard conteniendo la solución de Ringer normaladecuada para cada preparación. Para ratón, (en mM): NaCl, l37; KCl, 5; CaCl2, 2; MgSO4, 1; NaHCO3, 12; Na2HPO4, 1; glucosa, 11, continuamente burbujeados con 95% O2/5% CO2. Para rana, (en mM): NaCl, ll5; KCl, 2; CaCl2, l.8; MgCl2, 1 y HEPES, 5; pH 7.3. Lapreparación fue luego transferida a la cámara de registros a la cual se le suministró lasdistintas soluciones de trabajo. Los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente (19-23 °C), excepto en algunos casos en los cuales se varió la temperatura de la cámara deregistros. la misma fue controlada (i l °C) por medio de dispositivos termoeléctricos Peltier. Los potenciales de placa evocados (EPPs) y espontáneos (MEPPs) fueron registradosintracelularmente con microelectrodos de vidrio convencionales llenados con KCl 3M (resistencia 10-20 MΩ). El contenido cuántico de la respuesta evocada en solución de Ringernormal se evaluó por el método de la varianza (Martin, 1966). La contracción muscular fuesuprimida por medio de d-tubocurarina. Luego de impalar una fibra muscular, el nervio fueestimulado, mediante un electrodo de succión, en forma continua durante 1 min a 0.5 Hz yluego se registraron 50-100 EPPs sucesivos. En las solución de bajo Ca²+-alto Mg²+, elcontenido cuántico se evaluó por el método directo o por el método de las fallas (Martin, 1966). Las corrientes presinápticas se registraron mediante microelectrodos de vidrio llenadoscon NaCl 2M (resistencia 5-15 MΩ) insertados, bajo control visual, en la vaina perineural delas ramas finas del nervio (Mallart, l985a). Los músculos fueron incubados en solución de Ringer normal en presencia d-tubocurarina 30-50 μM. La Ica y la Ik(ca) se obtuvieronmediante el agregado de bloqueantes de los canales de potasio. Para discriminar los distintos tipos de canales de Ca²+ presentes en estos terminales motoresse utilizaron las siguientes drogas y toxinas: Nitrendipina, una dihidropiridina antagonista delos CCVD de tipo L. FTX, toxina derivada del veneno de la araña Agelenopsis aperta,bloqueante de los CCVD de tipo P w-AgaIVA, toxina derivada del veneno de la araña Agelenopsis aparta, bloqueante de los CCVD de tipo P y Q. w-CgTx, toxina derivada delveneno del caracol marino Conus geographus bloqueante de los CCVD de tipo N. w-MVIIDy w-MVIIC toxinas derivadas del veneno del caracol marino Conus magus, bloqueantes de loscanales de tipo N, P y Q. Resultados Placa Neuromuscular Normal del Ratón La w-AgaIVA (l00 nM) y las omega conotoxinas w-MVIIC (1 μM) y w-MVIID (3 μM),antagonizaron fuertemente la liberación del neurotransmisor (> 80-90% de bloqueo). La w-CgTx (5 μM) y la nitrendipina (10-20 μM) no resultaron efectivas. La liberación fue más sensible a la acción de la w-MVIIC (IC50 = 39 nM) que a la w-MVIID (le0 = 1.37 pM). Luego de bloquear la liberación casi completamente (contenido cuántico ~ 0.3% de su valor control) con w-MVIIC 3 μM, elevar la [Ca²+]ext de 2 a lO mM causó unincremento de ~2Ox, tanto en el contenido cuántico estimado como en la amplitud del EPP. La liberación evocada en solución de bajo Ca²+-alto Mg²+ (baja probabilidad de liberación,contenido cuántico = 2.02 ± 0.08) y la liberación evocada en Ringer normal (contenidocuántico = 90.5 ± 3.7) presentaron la misma sensibilidad a la acción de la w-AgaIVA (IC50= 16.8 nM y 14.4 nM, respectivamente) Tanto la Ica como la Ikca, resultaron altamente sensibles a bajas dosis de w-AgaIVA (10-30nM). Estas corrientes presinápticas fueron también fuertemente antagonizadas por la w-MVIIC (1 μM). Placa Neuromuscular Normal de la Rana La liberación evocada fue bloqueada por la FTX (IC50 = 0.02 μl/ml) y por la w-CgTx (1 μM)pero no fue afectada por la w-AgaIVA (0.5 μM). La FTX (0.1 μl/ml) causó un incremento de ~2x en la frecuencia de MEPPs tanto en la solución de Ringer normal como en la de bajo Ca²+/alto Mg²+ y no afectó la amplitud de los MEPPs en ninguna de las dos condiciones. La Ica fue bloqueada completamente por la w-CgTx (5 μM), parcialmente bloqueada por la FTX (l μl/ml) y no fue afectada por la w-AgaIVA (0.5 μM). La Ikca resultó fuertemente antagonizada por la caribdotoxina (300 nM), bloqueante de loscanales de K+ activados por Ca²+, y completamente suprimida por BaCl2 (200 μM). Estacorriente fue también bloqueada por la w-CgTx (5 μM) y por CdCl2 (200 μM) pero no fueafectada por la FTX (1 μl/ml). El bloqueo ejercido por la w-CgTx no pudo ser revertido por elaumento del [Ca²+]ext a 10 mM. Placa Neuromuscular de Ratón en Regeneración La liberación evocada neuralmente fue bloqueada por la w-AgaIVA, (30 y 100 nM causaron ~50 y 90% de inhibición, respectivamente). La w-CgTx (1 y 5 μM), como ocurre en las placasnormales, no afectó significativamente este tipo de liberación durante la reinervación. Lanitrendipina (1-10 μM), antagonizó fuertemente la liberación (~40-6 Consulte el resumen completo en el documento. |
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tesis:tesis_n2909_Katz2023-10-02T19:42:25Z Canales de calcio y liberación del neurotransmisor en sinapsis normales y en regeneración de la placa neuromuscular de vertebrados Katz, Eleonora Uchitel, Osvaldo Daniel PLACA NEUROMUSCULAR CANALES DE CALCIO LIBERACION DEL NEUROTRASMISOR TRANSMISION SINAPTICA REINERVACION REGENERACION CORRIENTES PRESINAPTICAS CORRIENTE DE CALCIO CORRIENTE DE POTASIO ACTIVADA POR CALCIO DIHIDROPIRINAS OMEGA CONOTOXINAS OMEGA AGATOXINA IVA NEUROMUSCULAR JUNCTION CALCIUM CHANNELS TRANSMITTER RELEASE SYNAPTIC TRANSMISSION REINNERVATION REGENERATION PRESYNAPTIC CURRENTS PERINEURIAL CURRENTS CALCIUM CURRENT CALCIUM-ACTIVATED POTASSIUM CURRENT DIHYDROPYRIDINES OMEGA CONOTOXINS OMEGA AGATOXIN IVA El Ca²+ es un eslabón clave entre la llegada del potencial de acción al terminal sináptico y laliberación del neurotransmisor (Katz, 1969; Katz & Miledi, 1970). El rápido incremento en [Ca²+]ext que ocurre ante la despolarización de la membrana terminal es el resultado de laapertura de canales de Ca²+ dependientes de voltaje (CCVD) que permiten la entrada de Ca²+desde el medio extracelular (Llinás y col., 1976; Augustine & Charlton, 1986). Basándose ensus características biofísicas y farmacológicas se han descripto varias clases de CCVD, loscuales han sido clasificados en los tipos T, L, N y P (Bean 1989; Llinás y col., 1992; Olivera ycol., l994; Dunlap y col., 1995). Más recientemente han sido descriptos los canales de tipo Q,un tipo de canal estrechamente relacionado con los de tipo P, y los canales tipo R, los cualesson resistentes a cualquiera de las drogas y toxinas antagonistas de los otros tipos de CCVD (Zhang y col., l993; Randall & Tsien, l995). Se ha mostrado que varios de estos CCVD,particularmente los de tipo N, L, P y Q, están involucrados en la liberación delneurotransmisor en diferentes sinapsis (ver Olivera y col., 1994; Dunlap y col., 1995). En Ia placa neuromuscular madura del ratón, la transmisión sináptíca es mediada por laentrada de Ca²+ a través de canales de tipo P (y/o Q) (Uchitel y col, l992; Protti & Uchitel, 1993; Bowersox y col., 1995; Hong & Chang, 1995; Wright & Angus, 1996). En estapreparación se ha demostrado que la w-AgaIVA, un bloqueante de CCVD de tipo P y Q,ejerce un fuerte efecto inhibitorio sobre la liberación de [³H]ACh (Wessler y col., 1995), lascorrientes presinápticas de Ca²+ y sobre la liberación evocada neuralmente y por alto K+ (Protti & Uchitel, l993, Hong & Chang, 1995; Bowersox y col., 1995; Wright & Angus, 1996). En vista de la falta de efectos de la (w-CgTx (Sano y col., 1987, Protti y col., 1991; Bowersox y col., 1995) y las DHPs (Atchinson, 1989), se piensa que los canales de tipo N y Lno tienen una participación significativa en el proceso de liberación en condiciones normales. En la placa neuromuscular de la rana, se demostró que la w-CgTx ejerce un fuerte efectoantagónico sobre la liberación (Kerr & Yoshikami, 1984; Sano y col., 1987; Koyano y col., 1987) mientras que los antagonistas de los canales de tipo L resultan ineficaces (Sano y col., 1987). Se ha demostrado también que los sitios de unión de la w-CgTx están co-localizadoscon las zonas activas de liberación dela presinapsis enfrentados justo a los sitios de unión dela α-bungarotoxina en la postsinapsis (Robitaille y col., 1990; Cohen y col., 1991). Estasevidencias indican que los canales de tipo N se hallan involucrados en el proceso deliberación en este sistema. Durante el curso de la maduración de la unión neuromuscular devertebrados, se han reportado cambios en la farmacología de los CCVD acoplados al procesode liberación en aves (Gray y col., l992) y anfibios (Fu & Huang, 1994). Se desconoce, sinembargo, la farmacología de los canales de Ca²+ acoplados al proceso de liberación en lassinapsis recientemente formadas de la unión neuromuscular de mamíferos. Objetivos El propósito de este estudio fue evaluar por medio de técnicas electrofisiológicas yfarmacológicas que tipos de CCVD están involucrados en la liberación del neurotransmisoren la placa neuromuscular normal de mamíferos (ratón) y anfibios (rana) y correlacionar elperfil farmacológico del proceso de liberación con el de las corrientes presinápticas de calcioy de potasio activada por calcio, Ica, y Ikca, respectivamente. Otro objetivo del presente trabajofue evaluar si se producen cambios en los CCVD acoplados al proceso de liberación durantela reinervación de la placa neuromuscular. Métodos Para estudiar la placa neuromuscular normal del ratón, los experimentos se llevaron a cabo enel músculo diafragma o en el levator auris longus de ratones macho adultos de la cepa Swissde 20-30 g de peso corporal. Para estudiar las placas del ratón durante la regeneración, seutilizaron ratones adultos a los cuales se les había provocado un daño “crush” a la ramaauricular posterior del nervio facial que inerva al levator auris izquierdo. Los animales controly los desnervados en diferentes etapas luego de la restauración de la transmisión sinápticafueron anestesiados e inmediatamente desangrados. Par estudiar la placa neuromuscular de larana los experimentos se realizaron en el músculo cutaneous pectoris de Rana caluesbiana de 40-60 g de peso corporal. Las ranas fueron matadas por doble punción (medular-cerebral). Elmúsculo correspondiente, junto con el nervio motor que lo inerva, fue removido y luegodisecado en una caja de Petri con base de Sylgard conteniendo la solución de Ringer normaladecuada para cada preparación. Para ratón, (en mM): NaCl, l37; KCl, 5; CaCl2, 2; MgSO4, 1; NaHCO3, 12; Na2HPO4, 1; glucosa, 11, continuamente burbujeados con 95% O2/5% CO2. Para rana, (en mM): NaCl, ll5; KCl, 2; CaCl2, l.8; MgCl2, 1 y HEPES, 5; pH 7.3. Lapreparación fue luego transferida a la cámara de registros a la cual se le suministró lasdistintas soluciones de trabajo. Los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente (19-23 °C), excepto en algunos casos en los cuales se varió la temperatura de la cámara deregistros. la misma fue controlada (i l °C) por medio de dispositivos termoeléctricos Peltier. Los potenciales de placa evocados (EPPs) y espontáneos (MEPPs) fueron registradosintracelularmente con microelectrodos de vidrio convencionales llenados con KCl 3M (resistencia 10-20 MΩ). El contenido cuántico de la respuesta evocada en solución de Ringernormal se evaluó por el método de la varianza (Martin, 1966). La contracción muscular fuesuprimida por medio de d-tubocurarina. Luego de impalar una fibra muscular, el nervio fueestimulado, mediante un electrodo de succión, en forma continua durante 1 min a 0.5 Hz yluego se registraron 50-100 EPPs sucesivos. En las solución de bajo Ca²+-alto Mg²+, elcontenido cuántico se evaluó por el método directo o por el método de las fallas (Martin, 1966). Las corrientes presinápticas se registraron mediante microelectrodos de vidrio llenadoscon NaCl 2M (resistencia 5-15 MΩ) insertados, bajo control visual, en la vaina perineural delas ramas finas del nervio (Mallart, l985a). Los músculos fueron incubados en solución de Ringer normal en presencia d-tubocurarina 30-50 μM. La Ica y la Ik(ca) se obtuvieronmediante el agregado de bloqueantes de los canales de potasio. Para discriminar los distintos tipos de canales de Ca²+ presentes en estos terminales motoresse utilizaron las siguientes drogas y toxinas: Nitrendipina, una dihidropiridina antagonista delos CCVD de tipo L. FTX, toxina derivada del veneno de la araña Agelenopsis aperta,bloqueante de los CCVD de tipo P w-AgaIVA, toxina derivada del veneno de la araña Agelenopsis aparta, bloqueante de los CCVD de tipo P y Q. w-CgTx, toxina derivada delveneno del caracol marino Conus geographus bloqueante de los CCVD de tipo N. w-MVIIDy w-MVIIC toxinas derivadas del veneno del caracol marino Conus magus, bloqueantes de loscanales de tipo N, P y Q. Resultados Placa Neuromuscular Normal del Ratón La w-AgaIVA (l00 nM) y las omega conotoxinas w-MVIIC (1 μM) y w-MVIID (3 μM),antagonizaron fuertemente la liberación del neurotransmisor (> 80-90% de bloqueo). La w-CgTx (5 μM) y la nitrendipina (10-20 μM) no resultaron efectivas. La liberación fue más sensible a la acción de la w-MVIIC (IC50 = 39 nM) que a la w-MVIID (le0 = 1.37 pM). Luego de bloquear la liberación casi completamente (contenido cuántico ~ 0.3% de su valor control) con w-MVIIC 3 μM, elevar la [Ca²+]ext de 2 a lO mM causó unincremento de ~2Ox, tanto en el contenido cuántico estimado como en la amplitud del EPP. La liberación evocada en solución de bajo Ca²+-alto Mg²+ (baja probabilidad de liberación,contenido cuántico = 2.02 ± 0.08) y la liberación evocada en Ringer normal (contenidocuántico = 90.5 ± 3.7) presentaron la misma sensibilidad a la acción de la w-AgaIVA (IC50= 16.8 nM y 14.4 nM, respectivamente) Tanto la Ica como la Ikca, resultaron altamente sensibles a bajas dosis de w-AgaIVA (10-30nM). Estas corrientes presinápticas fueron también fuertemente antagonizadas por la w-MVIIC (1 μM). Placa Neuromuscular Normal de la Rana La liberación evocada fue bloqueada por la FTX (IC50 = 0.02 μl/ml) y por la w-CgTx (1 μM)pero no fue afectada por la w-AgaIVA (0.5 μM). La FTX (0.1 μl/ml) causó un incremento de ~2x en la frecuencia de MEPPs tanto en la solución de Ringer normal como en la de bajo Ca²+/alto Mg²+ y no afectó la amplitud de los MEPPs en ninguna de las dos condiciones. La Ica fue bloqueada completamente por la w-CgTx (5 μM), parcialmente bloqueada por la FTX (l μl/ml) y no fue afectada por la w-AgaIVA (0.5 μM). La Ikca resultó fuertemente antagonizada por la caribdotoxina (300 nM), bloqueante de loscanales de K+ activados por Ca²+, y completamente suprimida por BaCl2 (200 μM). Estacorriente fue también bloqueada por la w-CgTx (5 μM) y por CdCl2 (200 μM) pero no fueafectada por la FTX (1 μl/ml). El bloqueo ejercido por la w-CgTx no pudo ser revertido por elaumento del [Ca²+]ext a 10 mM. Placa Neuromuscular de Ratón en Regeneración La liberación evocada neuralmente fue bloqueada por la w-AgaIVA, (30 y 100 nM causaron ~50 y 90% de inhibición, respectivamente). La w-CgTx (1 y 5 μM), como ocurre en las placasnormales, no afectó significativamente este tipo de liberación durante la reinervación. Lanitrendipina (1-10 μM), antagonizó fuertemente la liberación (~40-6 Consulte el resumen completo en el documento. Ca²+ is a key link between the arrival of an action potential to the synaptic terminal and therelease of neurotransmitter (Katz, 1969; Katz & Miledi, 1970). The rapid increase in [Ca²+]ithat occurs upon depolarization of the terminal membrane is accomplished by the opening ofvoltage gated calcium channels (VDCC) that allow the entry of Ca²+ from the extracellularspace (Llinás et al, 1976; Augustine & Charlton, 1986). Several types of VDCC have beendescribed based on their biophysical and pharmacological characteristics and classified intothe types T, L, N and P (Bean 1989; Llinás et al., l992; Olivera et al, 1994; Dunlap et al, 1995). More recently, the Q-type, a channel closer related to the P-type, and the R-type, achannel resistant to any of the drugs and toxins commonly used to block and discriminate theother types of VDCC, have been described (Zhang et al., 1993; Randall & Tsien, 1995). Manyof these VDCC, particularly the N, L, P and Q-types, have been shown to play a role insynaptic transmission at different synapses (for reviews see Olivera et al., 1994 and Dunlap etal., 1995). At the mature mouse neuromuscular junction, synaptic transmission is mediated by Ca²+ entrythrough P-type channels (and/or Q-type) (Uchitel et al., l992; Protti & Uchitel, 1993; Bowersox et al., 1995; Hong & Chang, 1995; Wright & Angus, 1996). In this preparation,omega agatoxin IVA, w-AgaIVA, a P- and Q-type VDCC blocker has been demonstrated toexert a strong inhibitory effect on [³H]ACh release (Wessler et al., 1995), calcium presynapticcurrents and on both neurally and K+-evoked transmission (Protti & Uchitel, 1993, Hong & Chang, 1995; Bowersox et al, 1995; Wright & Angus, 1996). In view of the lack of effects ofthe w-CgTx (Sano et a|., 1987, Protti et al., 1991; Bowersox et al., 1995) and DHPs (Atchinson, 1989), the N and L type channels are thought not to have a significantparticipation in the release process under normal conditions. At the frog neuromuscularjunction, w-CgTx, was shown, by electrophysiological studies, to strongly antagonizetransmitter release (Kerr & Yoshikami, 1984; Sano et al., 1987; Koyano et al, 1987) whereas L-type channel antagonists are ineffective (Sano et al., 1987). It has also been demonstratedthat w-CgTx binding sites are in close proximity to the presynaptic release active zones inregister with the α-bungarotoxin binding sites at the postsynapsis (Robitaille et al., 1990; Cohen et al., 199l). These results point to N-type channels as those most likely to be involvedin the release process in this system. During the course of maturation of the vertebrateneuromuscular junction, there have been reported changes in the pharmacology of the VDCCcoupled to the process of release in avian (Gray et al., 1992) and amphibian (Fu & Huang, 1994) preparations. Little is known, however, about the pharmacology of Ca²+ channelscoupled to the release process in recently formed synapses of the mammalian neuromuscularjunction. Aims In the present study we aimed at evaluating, by means of an electrophysiological andpharmacological approach, which type/s of VDCC are involved in transmitter release at themature mammalian (mouse) and amphibian (frog) neuromuscular junctions and to correlatethe pharmacological profile of the release process with that of the calcium and the calcium activatedpotassium presynaptic currents, Ica, and Ikca,respectively. We also aimed atevaluating whether there are changes in the channels coupled to the release process during theprocess of reinnervation of the mouse neuromuscular junction. Methods To study the mature mouse NMJ, the experiments were carried out on either the diaphragm orthe levator auris longus muscles of adult male Swiss mice weighing 20-30 g. To study theimmature mouse NMJ, adult mice were anesthetized with 2% tribromoethanol (0.15 ml/10 gbody wt; I.P.) and the posterior auricular branch of the facial nerve that supplies the leftlevator auris was crushed with forceps close to its entry to the caudal part of the muscle. Control (normal) and denervated animals at different stages after restoration of functionaltransmission were anesthetized and immediately exsanguinated. To study the frog NMJ, theexperiments were carried out on the isolated cutaneous pectoris preparation of the frog Ranacataesbiana weighing around 40-60 g. Frogs were killed by stunning immediately followed bydouble-pithing. The corresponding muscle with its nerve supply was excised and dissected ona Sylgard-coated Petri dish containing the corresponding normal Ringer solution. For mice, (in mM): NaCl, 137; KCl, 5; CaCl2, 2; MgSO4, 1; NaHC03, 12; Na2HPO4, 1; glucose, 11,continuously bubbled with 95% O2/5% CO2. For frogs, (in mM): NaCl, 115; KCl, 2; CaCl2, 1.8; MgCl2, 1 and HEPES, 5; pH 7.3). The preparation was then transferred to the recordingchamber to which the different working solutions and drugs were supplied. Experiments wereperformed at room temperature (19-23 °C). In some experiments the temperature in therecording chamber was controlled (± 1 °C) throughout the experiment by means of Peltierthermoelectric devices. Evoked endplate potentials (EPPs) and miniature endplate potentials (MEPPs) were recordedintracellularly with conventional glass microelectrodes filled with 3M KCl (10-20 MΩresistance). The mean quantal content of the evoked response in normal Ringer solution wasestimated by the coefficient of variation method (Martin, 1966). Muscle contraction wasprevented by d-Tubocurarine (d-Tc). After impalement of a muscle fibre, the nerve wascontinuously stimulated for 1 min at 0.5 Hz and then 50-100 successive EPPs were recorded (minimum 10 fibres per muscle). In the low Ca²+-high Mg²+ solutions the mean quantalcontent was evaluated by the either the direct or the failures method (Martin, 1966). Presynaptic currents were recorded by means of glass microelectrodes filled with 2 M NaCl (5-15 MΩ resistance) inserted, under visual control, into the perineurial sheath of smalldiameter nerve bundles (Mallart, l985a). The muscles were incubated in normal Ringersolution in the presence of 30-50 μM d-Tc in order to avoid any postsynaptic contribution tothe records. The Ica and Ikca were obtained in the presence of potassium channel blockers. To discriminate the different types of Ca²+ channels the following drugs and toxins wereused: Nitrendipine, a dihydropyridine antagonist of the L-type VDCC. FTX, a toxin derivedfrom the venom of the funnel-web spider Agelenopsis aperta, a P-type VDCC antagonist. Thetoxin w-AgaIVA, also derived from the venom of A. aperta, which blocks both P and Q-type VDCC. The toxin w-CgTx, derived form de venom of the marine snail Conus Geographus,which specifically blocks N-type channels and the toxins w-MVIIC and w-MVIID, bothderived from the venom of the marine snail Conus magus, which target P, Q and N-type VDCC. Results Normal mouse NMJw-AgaIVA (100 nM) and the omega contoxins w-MVIIC (1 μM) and w-MVIID (3 μM)strongly antagonized transmitter release (> 80-90% blockade) whereas w-CgTx (5 μM) andnitrendipine (10-20 μM) were ineffective. The process of release was much more sensitive to w-MVIIC (IC50= 39 nM) than to w-MVIID (IC50 = 1.37 μM). After almost completely blocking transmitter release (quantal content ~ 0.3% of its control value) with 3 μM w-MVIIC, elevating the external [Ca²+] from 2 to 10 mMinduced an increase of ~20-fold on the amplitude and quantal content of the EPP. Nerve-evoked transmitter release in a low Ca²+-high Mg²+ medium (low release probability:quantal content = 2.02 ± 0.08) and in the normal Ringer solution (quantal content = 90.5 ± 3.7) presented the same sensitivity to w-AgaIVA (IC50 = 16.8 nM and 14.4 nM, respectively). Both the calcium and calcium-dependent potassium presynaptic currents, Ica and Ikca,respectively, were highly sensitive to low doses (10-30 nM) of w-AgaIVA. The Ica and the Ikca,were also strongly antagonized by 1 μM w-MVIIC. The most remarkable difference betweenthe action of these two toxins was the long incubation times required to achieve maximaleffects with co-MVIIC. Normal Frog NMJ Evoked transmitter release was blocked by FTX (IC50 = 0.02 μl/ml) and by w-CgTx (1 μM)but was not affected by co-AgaIVA (0.5 μM). When FTX (0.1 μl/ml) was assayed onspontaneous release either in normal Ringer's or in low Ca²+/high Mg²+ solution, it was foundnot to affect miniature endplate potential (MEPP) amplitude but to increase MEPP frequencyby ~2-fold in both conditions. The Ica was blocked by w-CgTx (5 μM), partially blocked by FTX (1 μl/ml) and not affectedby w-AgaIVA (0.5 μM). The Ikca was strongly affected by charybdotoxin (ChTx) (300 nM), an antagonist of thecalcium-activated K+ channels and completely abolished by BaCl2 (200 μM). This currentwas also blocked by w-CgTx (5 μM) and by CdC12(200 μM) but was not affected by FTX (1μl/ml). The blockade by w-CgTx could not be reversed by elevating [Ca]o to 10 mM. Newly formed Mouse NMJ Nerve-evoked transmitter release was blocked by w-AgaIVA, (30 and 100 nM w-AgaIVAcaused ~50 and 90% inhibition, respectively). The toxin w-CgTx (1 and 5 μM), as occurs innormal preparations, did not significantly affect this type of release during reinnervation. Nitrendipine (1-10 μM), strongly antagonized release in these reinnervating muscles (~40-60%blockade). Spontaneous release was not dependent on Ca²+ entry through either P- or L-type VDCC. Neither 100 nM w-AgaIVA nor 10 μM nitrendipine affected the miniature endplate potential (MEPP) frequency or Consulte el resumen completo en el documento. Fil: Katz, Eleonora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1997 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2909_Katz |