Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales

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La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producciónde células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir delhallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo elnervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hor...

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Autor principal:	Chamorro, María Eugenia
Otros Autores:	Nesse, Alcira B.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2014
Materias:	ERITROPOYETINA CARBAMILADA ERITROPOYETINA PROLIFERACION CELULAR RECEPTOR DE ERITROPOYETINA RECEPTOR SS COMMON TIROSINA FOSFATASA 1B ERITROPOYESIS NEUROPROTECCION ERYTHROPOIETIN CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN CELL PROLIFERATION ERYTHROPOIETIN RECEPTOR SS COMMON RECEPTOR TYROSINE PHOSPHATASE 1B ERYTHROPOIESIS NEUROPROTECTION
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5510_Chamorro http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5510_Chamorro_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producciónde células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir delhallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo elnervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hormona, el cualestaría asociado a inhibición de apoptosis. Debido al interés por expandir el usofarmacológico de la Epo hacia la protección de tejidos no hematopoyéticos, seintensificó la búsqueda de estructuras modificadas de la proteína. La entidad quemerece, actualmente, mayor investigación es la Epo carbamilada en los residuoslisina (cEpo). Evidencia derivada de estudios in vitro y en animales deexperimentación indican que esta forma de Epo mantiene su actividadneuroprotectora mientras que carece de actividad eritropoyética. Esta diferentefunción evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento depacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadasen la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizóun modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar,en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayosparalelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médulaósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide,tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562,independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origenneuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante,utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones decianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo conrespecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína porcarbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye elobjetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron unasignificativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular porapoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferacióncelular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollode unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células demédula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquinaproinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a lainducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina encélulas neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías deseñalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultadosconfirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad paramantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroidepero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividadsimilar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en lascélulas SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a travésdel receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por unasubunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad delreceptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßcpara prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar sucapacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de célulaseritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización quejuegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien encultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2,primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad decEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lohace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo laexpresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, elarresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferacióncelular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización poraumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad deuna fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación dela señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B essignificativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estarasociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. Lacolocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasadesfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, enconsecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la accióndiferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides. Palabras claves: eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina, proliferacióncelular, receptor de eritropoyetina, receptor ß common, tirosina fosfatasa 1B,eritropoyesis, neuroprotección.
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Esta diferentefunción evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento depacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadasen la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizóun modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar,en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayosparalelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médulaósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide,tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562,independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origenneuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante,utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones decianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo conrespecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína porcarbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye elobjetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron unasignificativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular porapoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferacióncelular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollode unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células demédula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquinaproinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a lainducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina encélulas neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías deseñalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultadosconfirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad paramantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroidepero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividadsimilar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en lascélulas SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a travésdel receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por unasubunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad delreceptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßcpara prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar sucapacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de célulaseritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización quejuegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien encultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2,primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad decEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lohace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo laexpresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, elarresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferacióncelular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización poraumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad deuna fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación dela señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B essignificativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estarasociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. Lacolocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasadesfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, enconsecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la accióndiferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides. Palabras claves: eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina, proliferacióncelular, receptor de eritropoyetina, receptor ß common, tirosina fosfatasa 1B,eritropoyesis, neuroprotección. Erythropoietin (Epo) is known as the hormone regulating the production oferythroid cells. However, its biological role was expanded after the discovery ofspecific receptors expressed in other tissues, including the nervous tissue. Moreover, a neuroprotective effect that could be associated to apoptosis inhibitionwas described for the hormone. Due to the interest in expanding the pharmacological use of Epo over theprotection of non-hematopoietic tissues, the search for modified structures of theprotein became more intense. The chemical entity currently under investigation isthe Epo carbamylated in lysine residues (cEpo). Results from in vitro and in vivoexperiments indicate that this form of Epo retains its neuroprotective ability, whilelacking in erythropoietic activity. This different function would prevent anunnecessary increase in erythroid mass in non-anemic patients under treatmentfor neurodegenerative diseases. With an aim to further the existing knowledge of the changes observed in Epoafter carbamylation, in the present work we used a model involving physiologicalcells as well as cell lines, to globally and comparatively evaluate the effects of Epoand cEpo in parallel assays. Erythoid progenitor cells from mouse bone marrowwere used to study the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E). The cell lines capable of erythroid differentiation employed were UT-7, dependenton Epo for survival, TF-1, dependent on GM-CSF and able to proliferate in thepresence of Epo for short periods, and K562, independent of any specific growthfactor where cell line of neuronal origin was SH-SY5Y. The first step in the work consisted in the carbamylation of rhuEpo usingpotassium cyanide. This salt decomposes when dissolved generating an anionwhich allows it to bind the protein’s lysine residues. The carbamylation processwas carried out at different times and cyanide concentrations to ensure completebinding, and therefore the blockage of Epo’s lysine residues. The carbamylation of Epo was confirmed by gel electrophoresis, electrotransfer and immunodetection,where cEpo showed a decrease in positive charge due to the blockage of lysines,and consequently an increase in its net negative charge in comparison to Epo. Inthe carbamylation product (cEpo), a carbamyl group is coupled to each lysineresidue in the Epo molecule, thus modifying the protein structure and potentiallycausing functional alterations. In the presence of cEpo, cultures of UT-7 and TF-1 cells showed a significantdecrease in cell viability, leading to cell death by apoptosis, whereas Epomaintained viability and induced proliferation of both cell lines. cEpo did notsupport the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E) in cultures ofmouse bone marrow cells, nor did it prevent apoptosis induced by theproinflammatory cytokine TNF-α in erythroleucemic K562 cells differentiated withhemin. On the other hand, both cEpo and Epo acted as antiapoptotic agents protectingfrom the induction of programmed cell death by TNF-α or staurosporin inneuronal SH-SY5Y cells. Based on inhibition assays for intracellular signalingpathways, it may be suggested that the antiapoptotic action of cEpo and Epo ismediated by the activation of Jak2/PI3K. Our results confirmed that the modifications introduced in the Epo moleculeafter carbamylation produce a loss of its ability to support the survival of cellscapable of erythroid differentiation, but it does not affect its neuroprotective actionon SH-SY5Y cells, showing an activity similar to that of the native Epo. By carring out inhibition and competence assays, we found that Epo can actthrough both receptors involved in neuronal SH-SY5Y and TF-1 cells: thehomodimer (REpo/REpo) and the heterodimer comprising a REpo monomer and aßcommon subunit (Rßc), which is also present in the GM-CSF receptor. Weobserved that cEpo requires both REpo and the R c subunit to prevent apoptosisin neuronal cells. Owing to the fact that after carbamylation Epo maintains its antiapoptoticability but can no longer induce erythroid cell proliferation, the following objectiveof this work was to investigate the signaling pathways playing a key role in Epoinducedcell proliferation. Although in cultures of erythroid UT-7 and TF-1 cellscEpo induced Jak2 phosphorylation, which is the first step of cell activation, wedemonstrated for the first time that cEpo was unable to maintain Akt and FOXO3a phosphorylated for the same period of time as did Epo. Dephosphorylation of FOXO3a, which promotes its translocation to the nucleus asthe transcription factor for the cell cycle regulatory protein p27kip1, wasdemonstrated through an increase in the expression of the latter in cultures withcEpo. Since the differential effect of Epo and cEpo on cell proliferation may beassociated to the silencing of transduction pathways by an increase in thedephosphorylation rate, we analyzed the expression and activity of the tyrosinephosphatase 1B (PTP1B), involved in the the desregulation of Epo’s signalling. Wefound that PTP1B induction is significantly higher with cEpo, an increase whichseems to be linked with the rise in intracellular calcium induced by this factor. Co-localization of PTP1B and Rßc supports the conclusion that the enzymedephosphorylates Epo’s signalling faster than that of cEpo, thus interruptingpathways of survival, and consequently, of proliferation. This explains, at least inpart, the differential effects of Epo and cEpo on erythroid cells. Keywords: erythropoietin, carbamylated erythropoietin, cell proliferation,erythropoietin receptor, ß common receptor, tyrosine phosphatase 1B,erythropoiesis, neuroprotection. Fil: Chamorro, María Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5510_Chamorro spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ERITROPOYETINA CARBAMILADA ERITROPOYETINA PROLIFERACION CELULAR RECEPTOR DE ERITROPOYETINA RECEPTOR SS COMMON TIROSINA FOSFATASA 1B ERITROPOYESIS NEUROPROTECCION ERYTHROPOIETIN CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN CELL PROLIFERATION ERYTHROPOIETIN RECEPTOR SS COMMON RECEPTOR TYROSINE PHOSPHATASE 1B ERYTHROPOIESIS NEUROPROTECTION Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales Functional modification of erythropoietin due to carbamylation. Mechanisms of action on erythroid and neuronal cells info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5510_Chamorro_oai

Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales

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