Consecuencias de mutaciones y polimorfismos sobre la actividad de ADAMTS13

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Los objetivos de esta tesis fueron: 1- Optimizar la amplificación de los 29 exones correspondientes al gen de ADAMTS13 y realizar la secuenciación completa del gen en pacientes con PTT congénita y 2- Realizar la expresión “in vitro" de la primera nueva mutación descripta en Argentina A4085T (su...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Calderazzo Pereyra, Julio César
Otros Autores: Lazzari, María A.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2013
Materias:
ADAMTS13
DOMINIO CUB-2
A4085T
MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA
MUTACION DE SENTIDO ERRONEO D1362V
CUB-2 DOMAIN
SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
D1362V MISSENSE MUTATION
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5298_CalderazzoPereyra
https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5298_CalderazzoPereyra_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
Descripción
Sumario:Los objetivos de esta tesis fueron: 1- Optimizar la amplificación de los 29 exones correspondientes al gen de ADAMTS13 y realizar la secuenciación completa del gen en pacientes con PTT congénita y 2- Realizar la expresión “in vitro" de la primera nueva mutación descripta en Argentina A4085T (sustitución de un ácido aspártico (D) por una valina (V) en la posición 1362). Evaluar la actividad proteolítica intra y extracelular de la ADAMTS13 resultante para analizar cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de células HEK 293 transfectadas con las construcciones plasmídicas de la secuencia WT y del mutante A4085T sintetizado a partir del plásmido WT por mutagénesis sitio-dirigida para evaluar cuál es el dominio afectado y cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Estos estudios ayudaron a una mejor evaluación del exón 29 del dominio CUB-2. Para medir el antígeno y la actividad de ADAMTS13 en células, sobrenadantes y células transfectadas con vector de expresión de ADAMTS13 WT y de A4085T, se utilizaron técnicas de ELISA con sustratos cromogénicos, técnicas de SDS-PAGE, inmuno-transferencia y microscopia de inmunofluorescencia. Se observó que la mutación produce acumulación intracelular de ADAMTS13. La nueva mutación D1362V identificada en el dominio CUB-2 codificada por el exón 29, donde aún no se han reportado mutaciones de sentido erróneo, produce una deficiencia plasmática de ADAMTS13 que estaría inducida por una secreción reducida de la proteasa a la circulación.

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