Represión de la expresión génica mediante el secuestro de un coactivador : Transducción de la señal y elementos involucrados en la regulación ejercida por ésteres de forbol sobre el promotor del gen 5-aminolevulinato sintetasa

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Los factores de transcripción AP-1 (Activation protein-1) son genes tempranosinvolucrados en gran diversidad de procesos regulatorios. El éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-l3-acetato (TPA) es utilizado habitualmente para inducir la actividad de AP-1 y proteinquinasa C (PKC). El propósito de e...

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Autor principal: Guberman, Alejandra Sonia
Otros Autores: Cánepa, Eduardo Tomás
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2002
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3496_Guberman
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3496_Guberman_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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El vector de expresión,pALAS/CAT, produjo una significativa actividad CAT en células de hepatoma humano HepG2 transfectadas transientemente, que fue reprimida por TPA. Mediante análisis desecuencias y deleciones dctectamos un elemento de respuesta a TPA (TRE), localizado entre —261 y -255 que según establecimos por mutagénesis, es crítico para la regulación por TPA. Demostramos que c-Fos, c-Jun y JunD están involucrados en el efecto inhibitorio por suhabilidad de interactuar con TRE-ALAS, como evidenciamos por análisis de supershift y sucapacidad para reprimir la actividad del promotor en ensayos de transfección. Demostramos la participación de componentes de diferentes vías de señalización. Seencuentran involucradas la isoforma α de la PKC, la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), laquinasa regulada por señales extracelulares (ERK 1/2) y la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK). Asimismo, presentarnos a la quinasa p90RSK2 como un posible punto deconvergencia de las vías de PI3K y ERK. Mediante sobreexpresión de CBP (CRE protein binding protein) o p300, se bloqueósignificativamente la represión por TPA o sobreexpresión de Fos/Jun, de la actividad delpromotor de ALAS. Por otra parte, cuando el sitio TRE se ubicó en diferente contexto conrespecto a los sitios CRE, éste se comportó como un enhancer de la transcripción. Proponemos que la disminución en la actividad basal del promotor de ALAS enpresencia del TPA puede reflejar una disminución en la capacidad del promotor de ensamblarun complejo de pre-iniciación eficiente, debido al secuestro de CBP, por parte de AP-1. Asimismo, sugerimos que las propiedades transcripcionales del sitio TRE serian dependientesde la disposición espacial, con respecto a los sitios CRE. Activation protein -1 (AP-1) transcription factors are early response genes involved in adiverse set of transcriptional regulatory processes. The phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-l3-acetate (TPA) is often used to induce AP-1 and PKC activity. Thepurpose of this work is to explore the molecular mechanisms involved in the TPA regulationof 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression, the first and rate-controlling step ofthe heme biosynthesis. Previous analyses of the 5’-flanking sequence of ALAS revealed the existence of twocamp response elements (CRE) required for basal and cAMP-stimulated expression. Thefragment —833 to +42 in the 5’-flanking region of rat ALAS gene, was subcloned into achloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector. The expression vector,pALAS/CAT, produced a significant CAT activity in transiently transfected HepG2 humanhepatoma cells, which was repressed by TPA. Sequence and deletion analyses detected a TPAresponse element (TRE), located between —261 and —255 (TRE-ALAS), critical for TPAregulation, as we established by mutagenesis. We demonstrated that c-Fos, c-Jun, and JunDare involved in TPA inhibitory effect due to their ability to bind TRE-ALAS evidenced bysupershift analyses and their capacity to repress promoter activity in transfection assays. We demonstrated the participation of components of different signaling pathways. Theα isoform of proteinkinase C (α PKC), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), extracellularsignal regulated kinase (ERK 1/2) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) are involved. Thep90RSK2 is presented as a putative convergence point of the P13K and ERK pathways. Repression of ALAS promoter activity by TPA-treatment or Fos/Jun overexpressionwas largely relieved when CRE protein binding protein (CBP) or p300 was ectopicallyexpressed. When the TRE site was placed in a different context with respect to CRE sites, itappeared to act as a transcriptional enhancer. We propose that the decrease in ALAS basalactivity observed in the presence of TPA may reflect a lower ability of this promoter toassemble the productive pre-initiation complex due to CBP sequestration. We also suggestthat the transcriptional properties of this AP-1 site would depend of a spatial-disposition-dependentmanner with respect to the CRE sites. Fil: Guberman, Alejandra Sonia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3496_Guberman spa Universidad de Buenos Aires. 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