Síntesis de proteínas cuticulares durante la metamorfosis de la mosca mediterránea Ceratitis capitata

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Durante el desarrollo de la presente tesis se han estudiado loseventos moleculares que ocurren en la cutícula pupal y en el pupario en lasprimeras etapas de la metamorfosis. Estos fenómenos se correlacionaroncon eventos morfológicos estudiados simultáneamente por otros miembrosdel laboratorio (Rabos...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Boccaccio, Graciela Lidia
Otros Autores: Quesada-Allué, Luis Alberto
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1991
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2420_Boccaccio
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2420_Boccaccio_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Durante el desarrollo de la presente tesis se han estudiado loseventos moleculares que ocurren en la cutícula pupal y en el pupario en lasprimeras etapas de la metamorfosis. Estos fenómenos se correlacionaroncon eventos morfológicos estudiados simultáneamente por otros miembrosdel laboratorio (Rabossi et al., 1991; Rabossi 1991). De nuestros resultadosse concluye que Ceratitis es un buen modelo experimental para el estudiode la expresión génica durante el desarrollo de los dípteros. Hasta la fecha,el animal experimental más frecuentemente utilizado es Drosophilamelanogaster. Además de presentar interés por tratarse de una plaga cuya biología,bioquímica y genética han sido poco estudiadas (ver Introducción), Ceratitis presenta ciertas ventajas específicas respecto de otros modelos delaboratorio. El ciclo de vida de esta mosca presenta una duración mayorque el de Drosophila. A 23°C, entre el inicio de la pupariación y laemergencia, transcurren 4-4.5 días en Drosophila (Ashburner, 1989) y 12 días en Ceratitis (ver capítulo III, páginas 49-51). Los eventosmorfológicos y de diferenciación bioquímica que tienen lugar durante lametamorfosis ocurren más lentamente en esta última, lo cual facilita suestudio. Tratándose además de animales de mayor tamaño (4 y 1.5 mm,respectivamente), resulta ideal para el empleo de ciertas técnicas talescomo microinyección y disección. Parte de los resultados de esta tesis han sido publicados, o están envías de publicación, en los siguientes trabajos: Boccaccio y Quesada, l989a;l989b; Rabossi et al., 1991; Boccaccio y Quesada, 1991; Boccaccio y Quesada, manuscrito en preparación. Se resumen a continuación losresultados alcanzados: a. Hemos demostrado la existencia de grupos diferentes de proteínascuticulares en los diferentes estadíos del desarrollo de Ceratitis capitata. Estos grupos de proteínas son: las de primer y segundo estadío larval. lasde tercer estadío larval (LCP); las pupales (PCP) y las de adulto (ACP) (verfiguras III.6 y III.7). Nuestros estudios en Ceratitis capitata (Boccaccio y Quesada, l989a) y los realizados por otros autores en otros dípteros (Chihara et al., 1982; Skelly y Howells, 1988; Souliotis et al., l988a)demuestran que en estos insectos las proteínas cuticulares son específicasde estadío. b. Contrariamente a lo descripto en otros insectos, hemos encontradoque la fracción proteica de la cutícula pupal de Ceratitis está constituidacasi exclusivamente por un único polipéptido: PCG-100. En los otrosestadíos estudiados, se encontró una mezcla de distintas proteínas (vercapítulo III). c. Se prepararon antisueros en conejos contra proteínas cuticulares. Se obtuvieron antisueros monoespecíficos anti-PCG-lOO, con los cuales sedemostró que esta proteína es específica de estadío pupal y específica detegumento (ver capítulo IV; Boccaccio y Quesada, manuscrito enpreparación). d. Los estudios inmunológicos indicaron que la PCG-IOO de Ceratitisno comparte epítopes con otras proteínas cuticulares de ese insecto pero síestaría emparentada con la PCP-82 de Drosophila melanogaster. Esta últimaes la proteína cuticular pupal de mayor peso molecular de Drosophila, esespecífica de estadío y también está glicosilada (Chihara et al., 1982; Silvertet al., 1984). e. Hemos estudiado el grado de glicosilación de las proteínascuticulares de distintos estadíos de Ceratitis, encontrando que,analogamente a lo descripto para Drosophila melanogaster, las LCP estánpoco glicosiladas, en tanto que se detectaron glicoproteínas entre las PCP (ver capítulo VII; Boccaccio y Quesada, l989a). f. Se demostró la presencia de fucosa y manosa en la proteínacuticular pupal mayoritaria. PCG-lOO por radiomarcación in vivo con 2[^(3)H]-manosa y [^(14)C]-glucosa (ver capítulo VII). Hasta donde sabemos. sólorecientemente se demostró la presencia de fucosa en oligosacáridos de altamanosa en insectos (Guillén et al., 1989); pero el caso de PCG-lOO es elprimero en que se describe una glicoproteína individual de insecto del tipode alta manosa que, además, contiene fucosa. Algo similar ha sido descriptoanteriormente en moluscos y plantas (van Kuik et al., 1985; Faye et al. 1989). g. Se estudió la biosíntesis de las proteínas cuticulares durante elestadío pupal de Ceratitis capitata mediante microinyección de [^(35)S]-metionina. Es la primera vez que se realiza in vivo, en condicionesestrictamente fisiológicas, el estudio de la síntesis de proteínas cuticularesde insecto (Boccaccio y Quesada, l989a). Las proteínas cuticulares pupalesmostraron un período de síntesis breve y preciso, al comienzo del estadíopupal (ver capítulo VI). h. Se analizó la síntesis de la proteína cuticular pupal mayoritaria, PCG-lOO, y su presencia en la cutícula (páginas 124-131). Encontramos queesta proteína se sintetiza principalmente entre las 48 y 64 horas desde elcomienzo de la pupariación y está presente durante todo el estadío pupal (hasta el sexto día) (Boccaccio y Quesada, l989a; Boccaccio y Quesada,manuscrito en preparación). Como se discute en los capítulos III y VI, la “desaparición” de esta proteína puede deberse a que se degrada o seesclerotiza. i. También por radiomarcación ln vivo, seguida de “Chase” ¡n vitro (capítulo VII) se estudió el proceso de síntesis, glicosilación, procesamiento,exportación y deposición en cutícula de PCG-lOO. Hasta donde sabemos, esla primera vez que se realiza este tipo de estudio para el caso de unaproteína cuticular. Hemos encontrado que el proceso completo ocurre rápidamente, enunos lO minutos. No hemos detectado diferencias en el peso molecularaparente de PCG-lOO durante el pasaje por el retículo y aparato de Golgi. Esto sería indicativo de que no se agregan a PCG-lOO largas cadenasoligosacarídicas, en concordancia con los experimentos que realizamos paracaracterizar los oligosacáridos unidos a esta proteína. Tampocoencontramos diferencias significativas de peso molecular entre la(s)especie(s) intracelular(es) de esta proteína y la depositada en cutícula. j. Hemos detectado la existencia de proteínas que aparentemente seincorporarían al pupario durante su formación. Estos estudios se hicieronen colaboración con Pablo Wappner (Rabossi et al., 1991). Es la primera vezque se describe este fenómeno, para el cual existen varias posiblesexplicaciones (ver capítulo VIII). k. Hemos estudiado la síntesis de la más abundante de estasproteínas, la PMP-26, por radiomarcación in vivo con [^(35)S]-metionina. Aparentemente, se sintetizaría durante la etapa pre-pupal (16-30 horas) yse depositaría en el pupario bastante después, hacia las 46-48 horas. Elhecho de que su incorporación al pupario se produce masivamente ybastante después de su síntesis, sugiere que debe existir un mecanismo deacumulación (vesículas?) y que la exportación y/o deposición estaríanestrictamente controladas en el tiempo. l. Se han realizado estudios comparados a nivel de ácidos nucleicos,intentando detectar secuencias homológas entre genes de proteínascuticulares de Drosophila melanogaster y de Ceratitis capitata. Se iniciaronpasos experimentales que posibilitarán el clonado del gen codificante para PCG-lOO.
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spelling I28-R145-tesis_n2420_Boccaccio_oai2023-04-26 Quesada-Allué, Luis Alberto Boccaccio, Graciela Lidia 1991 Durante el desarrollo de la presente tesis se han estudiado loseventos moleculares que ocurren en la cutícula pupal y en el pupario en lasprimeras etapas de la metamorfosis. Estos fenómenos se correlacionaroncon eventos morfológicos estudiados simultáneamente por otros miembrosdel laboratorio (Rabossi et al., 1991; Rabossi 1991). De nuestros resultadosse concluye que Ceratitis es un buen modelo experimental para el estudiode la expresión génica durante el desarrollo de los dípteros. Hasta la fecha,el animal experimental más frecuentemente utilizado es Drosophilamelanogaster. Además de presentar interés por tratarse de una plaga cuya biología,bioquímica y genética han sido poco estudiadas (ver Introducción), Ceratitis presenta ciertas ventajas específicas respecto de otros modelos delaboratorio. El ciclo de vida de esta mosca presenta una duración mayorque el de Drosophila. A 23°C, entre el inicio de la pupariación y laemergencia, transcurren 4-4.5 días en Drosophila (Ashburner, 1989) y 12 días en Ceratitis (ver capítulo III, páginas 49-51). Los eventosmorfológicos y de diferenciación bioquímica que tienen lugar durante lametamorfosis ocurren más lentamente en esta última, lo cual facilita suestudio. Tratándose además de animales de mayor tamaño (4 y 1.5 mm,respectivamente), resulta ideal para el empleo de ciertas técnicas talescomo microinyección y disección. Parte de los resultados de esta tesis han sido publicados, o están envías de publicación, en los siguientes trabajos: Boccaccio y Quesada, l989a;l989b; Rabossi et al., 1991; Boccaccio y Quesada, 1991; Boccaccio y Quesada, manuscrito en preparación. Se resumen a continuación losresultados alcanzados: a. Hemos demostrado la existencia de grupos diferentes de proteínascuticulares en los diferentes estadíos del desarrollo de Ceratitis capitata. Estos grupos de proteínas son: las de primer y segundo estadío larval. lasde tercer estadío larval (LCP); las pupales (PCP) y las de adulto (ACP) (verfiguras III.6 y III.7). Nuestros estudios en Ceratitis capitata (Boccaccio y Quesada, l989a) y los realizados por otros autores en otros dípteros (Chihara et al., 1982; Skelly y Howells, 1988; Souliotis et al., l988a)demuestran que en estos insectos las proteínas cuticulares son específicasde estadío. b. Contrariamente a lo descripto en otros insectos, hemos encontradoque la fracción proteica de la cutícula pupal de Ceratitis está constituidacasi exclusivamente por un único polipéptido: PCG-100. En los otrosestadíos estudiados, se encontró una mezcla de distintas proteínas (vercapítulo III). c. Se prepararon antisueros en conejos contra proteínas cuticulares. Se obtuvieron antisueros monoespecíficos anti-PCG-lOO, con los cuales sedemostró que esta proteína es específica de estadío pupal y específica detegumento (ver capítulo IV; Boccaccio y Quesada, manuscrito enpreparación). d. Los estudios inmunológicos indicaron que la PCG-IOO de Ceratitisno comparte epítopes con otras proteínas cuticulares de ese insecto pero síestaría emparentada con la PCP-82 de Drosophila melanogaster. Esta últimaes la proteína cuticular pupal de mayor peso molecular de Drosophila, esespecífica de estadío y también está glicosilada (Chihara et al., 1982; Silvertet al., 1984). e. Hemos estudiado el grado de glicosilación de las proteínascuticulares de distintos estadíos de Ceratitis, encontrando que,analogamente a lo descripto para Drosophila melanogaster, las LCP estánpoco glicosiladas, en tanto que se detectaron glicoproteínas entre las PCP (ver capítulo VII; Boccaccio y Quesada, l989a). f. Se demostró la presencia de fucosa y manosa en la proteínacuticular pupal mayoritaria. PCG-lOO por radiomarcación in vivo con 2[^(3)H]-manosa y [^(14)C]-glucosa (ver capítulo VII). Hasta donde sabemos. sólorecientemente se demostró la presencia de fucosa en oligosacáridos de altamanosa en insectos (Guillén et al., 1989); pero el caso de PCG-lOO es elprimero en que se describe una glicoproteína individual de insecto del tipode alta manosa que, además, contiene fucosa. Algo similar ha sido descriptoanteriormente en moluscos y plantas (van Kuik et al., 1985; Faye et al. 1989). g. Se estudió la biosíntesis de las proteínas cuticulares durante elestadío pupal de Ceratitis capitata mediante microinyección de [^(35)S]-metionina. Es la primera vez que se realiza in vivo, en condicionesestrictamente fisiológicas, el estudio de la síntesis de proteínas cuticularesde insecto (Boccaccio y Quesada, l989a). Las proteínas cuticulares pupalesmostraron un período de síntesis breve y preciso, al comienzo del estadíopupal (ver capítulo VI). h. Se analizó la síntesis de la proteína cuticular pupal mayoritaria, PCG-lOO, y su presencia en la cutícula (páginas 124-131). Encontramos queesta proteína se sintetiza principalmente entre las 48 y 64 horas desde elcomienzo de la pupariación y está presente durante todo el estadío pupal (hasta el sexto día) (Boccaccio y Quesada, l989a; Boccaccio y Quesada,manuscrito en preparación). Como se discute en los capítulos III y VI, la “desaparición” de esta proteína puede deberse a que se degrada o seesclerotiza. i. También por radiomarcación ln vivo, seguida de “Chase” ¡n vitro (capítulo VII) se estudió el proceso de síntesis, glicosilación, procesamiento,exportación y deposición en cutícula de PCG-lOO. Hasta donde sabemos, esla primera vez que se realiza este tipo de estudio para el caso de unaproteína cuticular. Hemos encontrado que el proceso completo ocurre rápidamente, enunos lO minutos. No hemos detectado diferencias en el peso molecularaparente de PCG-lOO durante el pasaje por el retículo y aparato de Golgi. Esto sería indicativo de que no se agregan a PCG-lOO largas cadenasoligosacarídicas, en concordancia con los experimentos que realizamos paracaracterizar los oligosacáridos unidos a esta proteína. Tampocoencontramos diferencias significativas de peso molecular entre la(s)especie(s) intracelular(es) de esta proteína y la depositada en cutícula. j. Hemos detectado la existencia de proteínas que aparentemente seincorporarían al pupario durante su formación. Estos estudios se hicieronen colaboración con Pablo Wappner (Rabossi et al., 1991). Es la primera vezque se describe este fenómeno, para el cual existen varias posiblesexplicaciones (ver capítulo VIII). k. Hemos estudiado la síntesis de la más abundante de estasproteínas, la PMP-26, por radiomarcación in vivo con [^(35)S]-metionina. Aparentemente, se sintetizaría durante la etapa pre-pupal (16-30 horas) yse depositaría en el pupario bastante después, hacia las 46-48 horas. Elhecho de que su incorporación al pupario se produce masivamente ybastante después de su síntesis, sugiere que debe existir un mecanismo deacumulación (vesículas?) y que la exportación y/o deposición estaríanestrictamente controladas en el tiempo. l. Se han realizado estudios comparados a nivel de ácidos nucleicos,intentando detectar secuencias homológas entre genes de proteínascuticulares de Drosophila melanogaster y de Ceratitis capitata. Se iniciaronpasos experimentales que posibilitarán el clonado del gen codificante para PCG-lOO. Fil: Boccaccio, Graciela Lidia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2420_Boccaccio spa Universidad de Buenos Aires. 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